La Citogenetica nella Diagnosi Prenatale
Per diagnosi prenatale si
intende l’insieme delle indagini
strumentali e di laboratorio
finalizzate ad individuare
determinate patologie su
base :
™ genetica
™ infettiva
™ iatrogena
Attualmente l’indagine citogenetica
per lo studio del cariotipo fetale
interessa circa l’80% delle diagnosi
prenatali eseguite per evidenziare
patologie genetiche.
Indicazioni alla diagnosi prenatale
” Eta’ materna > 35 anni
(l'aumento del rischio di aneuploidie cromosomiche correla con l'età
materna)
” Genitori con precedente figlio affetto da aneuploidia
(rischio di ricorrenza circa 1%)
” Genitori eterozigoti per anomalie cromosomiche bilanciate
(aumento del rischio di concepimenti sbilanciati)
” Anamnesi familiare positiva per patologia cromosomica
(analisi del cariotipo su sangue del genitore a rischio)
” Anamnesi familiare positiva per malformazioni congenite
” Evidenza ecografica di malformazioni fetali
(circa il 20% di questi feti è sbilanciato)
” Alterazioni biochimiche nella madre
(aumento dei valori di gonadotropina corionica, riduzione dell'alfafetoproteina e dell'estriolo non coniugato predicono nel Triplo-test il
70% delle gravidanze con feto
affetto da trisomia 21; >NT+free-beta hCG+PAPP-A predicono nel Bitest l’80-85% delle gravidanze con feto affetto da trisomia 18 o 21 )
” Malattie mendeliane
(analisi del DNA su villi coriali)
Tecniche di diagnosi prenatale
•AMNIOCENTESI (16-18 sett.gestazione)
•VILLOCENTESI
(11-12 sett.gestazione)
•FUNICOLOCENTESI (18 sett.- termine
gravidanza)
Funicolocentesi
Approccio tardivo alla diagnosi prenatale
(18 sett.->termine gravidanza)
•Fallimento della coltura dopo amniocentesi
•Mosaicismi presenti nelle cellule del LA
•Mosaicismi confinati alla placenta
•Riscontro ecografico di malformazione fetale
Cariotipo fetale da cellule
di liquido amniotico
Materiale esaminato: cellule
di liquido amniotico
(cellule di desquamazione provenienti da: sacco amniotico,
epidermide, mucosa del tubo digerente, del tratto
respiratorio e di quello urogenitale).
Metodica d’indagine:
•in situ: l’analisi avviene per
colonie.
Migliore valutazione diagnostica in caso di mosaicismo
cromosomico o di contaminazione materna.
Tempi di coltura più brevi.
•in fiasca:
si perde l’individualità dei cloni.
Maggiore crescita cellulare.
Cariotipo fetale da villi coriali
Materiale esaminato: cellule
del trofoblasto
Metodica d’indagine:
•coltura diretta: si analizzano le mitosi spontanee
presenti nel citotrofoblasto, dopo 48-72 ore dal
prelievo.
Rapidità.
Minore rischio di inquinamento da cellule materne.
Attività mitotica e qualità delle metafasi inferiori
rispetto alla tecnica della coltura.
•coltura a lungo termine: le colture vengono allestite
previo trattamento dei villi con enzimi proteolitici per
disgregare le cellule del cito e del sinciziotrofoblasto.
Contaminazione con cellule di origine materna.
CVS
Frequenza anomalie cromosomiche in
rapporto all’età materna
Età materna
Anomalie
numeriche
Trisomia 21
20 anni
1/530
1/1.530
25 anni
1/480
1/1.350
30 anni
1/390
1/900
34 anni
1/244
1/474
35 anni
1/170
1/350
39 anni
1/81
1/146
40 anni
1/60
1/110
45 anni
1/20
1/30
Problemi tecnici ed interpretativi
collegati alla diagnosi citogenetica
fetale
• Fallimento dello sviluppo della coltura cellulare in vitro
(<1%)
• Crescita in coltura di cellule di origine materna (CCM)
• Mosaicismo cromosomico, pseudomosaicismo (anomalie
in vitro oppure derivate da tessuti extraembrionali)
• Riarrangiamenti strutturali
• ESACs (Extra Structurally Abnormal Chromosome)
insorti de novo
Mosaicismo
Presenza in uno stesso individuo di due
o più linee cellulari a cariotipo diverso
•Livello III (mosaicismo vero)
•Livello II (pseudomosaicismo a cellule multiple)
•Livello I (pseudomosaicismo a singola cellula)
Caratteristiche dei mosaicismi
cromosomici
Errori postzigotici
Variabili nel tipo
Variabili nei diversi tessuti
Variabili nel tempo
Mosaicismo XX/XY
•Di solito è uno pseudomosaicismo (CCM in gravidanza
46,XY)
•Non documentabile in una gravidanza 46,XX
•Il mosaicismo XX/XY, di III livello si associa di
solito ad una femmina 46,XX (linea XY vanishing
twin)
•Importante e dirimente l’analisi ecografica dei
genitali esterni
Mosaicismo X/XY
•In postnatale fenotipo variabile : femmina con
fenotipoTurneriano, neonato con genitali ambigui,
maschio sterile
•In prenatale, maschi normale
•Monitoraggio ecografico
•Origine placentare della linea 45,X
Trisomia 20
•Di solito è contributo dagli amniociti, ed il feto ha un
cariotipo normale
•Raramente il mosaicismo causa difetti
•Rischio di patologia legato alla
aneuploide in >60% delle cellule
presenza
della
linea
Mosaicismo per isocromosoma autosomico
•Raro
•i(12p) associata alla Sindrome di Pallister Killian
non presente nel sangue
prognosi grave
•forme molto rare, a prognosi infausta
Riarrangiamenti strutturali
Bilanciati: spostamento di parti di un cromosoma
su di un altro o all’interno dello stesso, senza
modificare il contenuto genomico dell’individuo
(es.:traslocazioni, inversioni).
Frequenza nella popolazione 1:200
• familiari ( 1% rischio aggiuntivo di patologia)
• de novo ( 3-5% rischio aggiuntivo di patologia)
Sbilanciati: aumento o perdita di materiale
genetico (es.: duplicazioni, delezioni).
Frequenza 1:1000 diagnosi prenatali
46,XY,t(3;4)(q24;q34)
Traslocazioni de novo
Difficoltà a definire se il riarrangiamento sia
realmente bilanciato
In postnatale la presenza di un fenotipo
normale suggericse un’anomalia bilanciata
Frequenza: 1/2.000 amniocentesi; 1/9.000
quelle robertsoniane; 1/10.000 le inversioni
Meccanismi alla base di un effetto fenotipico:
• delezione
• duplicazione
• rottura di un gene
• effetto di posizione
Screening rapido
delle aneuploidie dei cromosomi
•FISH (Fluorescence in situ Hybridization)
Materiale esaminato: amniociti non coltivati
Tempi di risposta: 48-72 ore dall’arrivo del campione in laboratorio
Limiti diagnostici: valutazione parziale e limitata solo ai cromosomi
specificatamente ricercati (cromosomi 21,13,18,X,Y).
Limiti di affidabilità:
materiale da esaminare scarso
mosaicismi molto diluiti
•QF-PCR (Quantitative
Chain Reaction)
Fluorescence-Polymerase
QF-PCR
Estrazione del DNA da amniociti non coltivati
Analisi dei microsatelliti (cromosomi 13,18,21,X) ed
analisi del gene amelogenina in Xp ed Yp mediante
PCR
Analisi dei prodotti di PCR per elettroforesi
capillare, analisi dei frammenti e calcolo delle aree
sottostanti gli amplificati (picchi)
Vantaggi: rapidità, meno laboriosa, automatizzabile,
meno costosa
QF-PCR
Trisomia 21
Trisomia 18
FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization)
FISH
(Fluorescence in situ Hybridization)
• Studio delle traslocazioni
genoteche cromosoma specifiche(painting)
• Definizione più precisa dei punti di rottura
• Individuazione di riarrangiamenti criptici
(microdelezioni e/o microduplicazioni, riarrangiamenti
subtelomerici)
• Precisa definizione sullo status mono o dicentrico
delle traslocazioni robertsoniane.
• Caratterizzazione di marker sovrannumerari(ESAC)
• Identificazione di delezioni causa di sindromi da
geni contigui
• Origine e struttura dei cromosomi ad anello
ESAC in diagnosi prenatale
Frequenza 1:2500
Morfologia: ad anello (ring), metacentrico
Importante l’analisi dei genitori
(familiare vs de novo)
Mosaicismo vs aneuploidia omogenea
Con satelliti vs senza satelliti
1/3 presentano reperti ecografici patologici
(Warburton, Am J Hum Genet 49,995-1013,1991)
ESAC Familiari
In genere non comportano rischi per il feto
ESAC de novo
•I dati sui rischi empirici riflettono difetti di campionamento
•Non sono disponibili follow-up adeguati dei neonati
•Le anomalie diagnosticate sulle gravidanze interrotte riguardano solo i
difetti principali
•15% per ESAC non satellitati
•11% per ESAC satellitati
•Sottoclassificazione con bande C, Ag-NOR, Distamicina A/DAPI, FISH
ESACs in diagnosi prenatale:
approccio diagnostico
Prelievo ematico ai genitori
per controllo cariotipo
Caratterizzazione del marcatore con
tecniche di citogenetica molecolare (FISH)
ESAC(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
der 14/22
Ish.alfasat.14/22 +
IDENTIFICAZIONE DI RIARRANGIAMENTI
DELLE REGIONI SUBTELOMERICHE
LSI 1pter; LSI Xpter/Ypter
LSI 1qter; LSI Xpter/Ypter
CEP X
Dalla citogenetica tradizionale
alla CGH-Array
1970 Bandeggio standard
1980 Bandeggio ad alta risoluzione
1990 Citogenetica molecolare (FISH)
2002 Array-CGH (aCGH)
A-CGH: principi ed applicazioni in ambito diagnostico
Agli studenti è stato fornito materiale didattico cartaceo e
sono stati consigliati testi specifici dove poter approfondire
gli argomenti trattati a lezione.