DNAzima: un biosensore per gli ioni
K+ in soluzioni acquose
L. Bruni1,2,3 , S. Croci1,2,3
1Centro
Fermi – Museo Storico della Fisica e Centro Studi e
Ricerche Enrico Fermi – Roma; 2Dipartimento di Neuroscienze, Unità di
Biofisica e Fisica Medica, Università di Parma,
3Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi – Roma
Workshop : Biosensori innovativi per l’ambiente
e la salute. 14 Novembre 2014 Roma
DNAzima
Enzima a DNA
G-quadruplex - apoenzima
Emina – gruppo prostetico
Attività catalitica perossidasica
Gruppo prostetico - emina
Gruppo prostetico di alcune proteine
Quattro anelli pirrolici
emina
Ponti metinici
Atomo di Fe che coordina 4 N
Seguire il folding del G-quadruplex, tramite spettroscopia
UV-VIS e spettroscopia di fluorescenza
Apoenzima – G-quadruplex
G-quadruplex
Cationi monovalenti
K+> Na+ > Rb+ > NH4+ > Cs+ > Li+
Fundamentals of Quadruplex Structures G. N. Parkinson
Apoenzima – G-quadruplex
Perchè il K+?
Apoenzima – G-quadruplex
Phthalocyanines: a new class of G-quadruplex-ligands with many potential
applications. H. Yaku et al., Molecules 2012.
Apoenzima – G-quadruplex
DNAzima
DNAzima utilizzato come
biosensore per misurare la
concentrazione di K+ in
soluzioni acquose
Range di concentrazione
Sensibilità
Limite di rivelazione
DNAzima
DNA-enhanced peroxidase activity of a DNA aptamer-hemin complex
Paola Travascio, Yingfu Li and Dipankar Sen
Chemistry and Biology 5:505-517
DNA PS2.M
5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’
Buffer di folding 30’
G-quadruplex + emina
DNAzima
K+
oligonuceotidi
30’
G-quadruplex
DNAzima
30’
DNAzima foldato in presenza di [Na+]
͂ 30 mM - buffer di folding
TECNICHE
Dicroismo Circolare
Formazione G-quadruplex e topologia
Formazione DNAzima
(legame emina G-quadruplex)
Spettroscopia UV-VIS
Fonti di ioni
+
K
K:Cl 10 mM – 100 mM CD; 0 mM – 100 mM UV-VIS
Spettri CD G-quadruplex
Parallelo
15
10 mM KCl
20mM KCl
30mM KCl
Ellipticy (mdeg)
10
Antiparallelo
5
40mM KCl
50mM KCl
100mM KCl
nm
0
220
-5
-10
240
260
280
300
320
340
Spettri CD G-quadruplex
14
12
10
AU (262nm -291nm)
8
6
4
2
0
-2 0
-4
-6
-8
10
20
30
40
50
[KCl]
60
70
80
90
100
Spettri UV-VIS DNAzima
0,45
0,4
[KCl ]= 0.5 mM
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
0,35
Abs
0,3
0,25
emina
0,2
DNAzima
0,15
0,1
0,05
0
320
370
420
470
520
570
620
670
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,03
BANDA E (502 nm)
[KCl ]= 0.5 mM
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
Abs
0,025
emina
0,02
DNAzima
0,015
BANDA D (628.4 nm)
0,01
0,005
nm
0
450
500
550
600
650
Spettri UV-VIS DNAzima
0,45
0,4
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
0,35
0 mM KCl
0.5 mM KCl
Abs
0,3
1 mM KCl
0,25
2 mM KCl
0,2
3 mM KCl
0,15
4 mM KCl
0,1
5 mM KCl
0,05
0
320
370
420
470
520
570
620
670
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,46
0,45
Abs
0,44
0.5 mM KCl
0,43
1 mM KCl
0,42
2 mM KCl
3 mM KCl
0,41
4 mM KCl
0,4
5 mM KCl
0,39
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
0,38
397
399
401
403
405
407
409
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,04
0,035
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
0,03
0 mM KCl
0.5 mM KCl
Abs
0,025
1 mM KCl
0,02
2 mM KCl
3 mM KCl
0,015
4 mM KCl
0,01
5 mM KCl
0,005
0
450
500
550
600
650
nm
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,6
0,5
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
0,4
Abs
0 KCl
5 mM KCl
0,3
40 mM KCl
100 mM KCl
0,2
0,1
0
320
370
420
470
520
570
620
670
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,54
0,53
0,52
Abs
0,51
0,5
40 mM KCl
0,49
100 mM KCl
0,48
5mM KCl
0,47
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
0,46
0,45
0,44
397
399
401
403
405
407
409
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,05
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
Abs
0,04
0,03
0 kCl
40 mM KCl
100 mM KCl
0,02
5mM KCl
0,01
0
450
500
550
600
650
nm
Fonti di ioni
+
K
KCL 5mM – 100 mM CD; 0 mM – 100 mM UV-VIS
:
K D-rib 5mM = 15 mM K+
Spettri UV-VIS DNAzima
0,45
:
0,4
[K D-rib 5mM]
0,35
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
Abs
0,3
0,25
emina
0,2
K:D-rib 5 mM
0,15
0,1
0,05
0
320
370
420
470
520
570
620
670
nm
Abs
Spettri UV-VIS DNAzima
0,06
K:D-rib 5mM
0,05
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
0,04
BANDA E
(502 nm)
0,03
emina
K:D-rib 5 mM
BANDA D
(628 nm)
0,02
0,01
0
450
500
550
600
650
nm
Fonti di ioni
+
K
Hs 578T carcinoma mammario
umano con crescita in adesione
Trattato con K:D-rib 5mM 48h
DNAzima come biosensore di ioni K+
Fonti di ioni
+
K
KCL 5mM – 100 mM CD; 0 mM – 100 mM UV-VIS
K:D-rib 5mM = 15 mM K+
Surnatante linea cellulare Hs 578T trattata con K:D-rib 5mM per 48h
DMEM trattato con K:D-rib 5mM incubato a 37° 48h (DMEM [K+] =
5mM )
Surnatante linea cellulare Hs 578T di controllo
DMEM incubato a 37° 48h (DMEM [K+] = 5mM)
Spettri CD G-quadruplex
Parallelo
11
Extra_cell
9
Extra cellulare Tratt
7
Antiparallelo
5
DMEM
DMEM Tratt
3
1
-1 240
-3
-5
260
280
300
320
340
Spettri UV-VIS DNAzima
0,4
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
Abs
0,3
DMEM
DMEM tratt
0,2
Surnatante
Surn Trattato
0,1
0
320
370
420
470
520
570
620
670
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,43
0,42
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
Abs
0,41
0,4
DMEM
0,39
DMEM tratt
0,38
Surnatante
Surn Trattato
0,37
0,36
0,35
0,34
396
398
400
402
404
406
408
410
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,03
[Na+ ] buffer ͂ 30 mM
0,025
Abs
0,02
DMEM
DMEM tratt
0,015
Surnatante
0,01
Surn Trattato
0,005
0
450
500
550
600
650
nm
Ed in presenza di Na+ che cosa accade?
[Na+] ͂ 30 mM
Nel buffer di spettroscopia
[Na+] nel mezzo extracellulare
155 mM
Spettri UV-VIS DNAzima
0,3
[Na+] ͂ 30 mM - buffer
Abs
0,25
0,2
emina
0,15
Na+ Buffer folding
0,1
0,05
0
320
370
420
470
520
570
620
670
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,06
[Na+] ͂ 30 mM - buffer
Abs
0,05
0,04
emina
0,03
Na+ buffer folding
0,02
0,01
0
450
500
550
600
650
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,4
[Na+] ͂ 30 mM - buffer
0,35
Abs
0,3
0,25
20 mM NaCl
0,2
100 mM NaCl
[Na+] ͂ 30 mM mM
0,15
0,1
0,05
0
320
370
420
470
520
570
620
670
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,355
[Na+] ͂ 30 mM - buffer
0,35
0,345
0,34
Abs
0,335
20 mM NaCl
0,33
100 mM NaCl
0,325
0,32
0,315
0,31
397
399
401
403
405
407
409
nm
Spettri UV-VIS DNAzima
0,04
[Na+] ͂ 30 mM - buffer
0,035
0,03
Abs
0,025
20 mM NaCl
0,02
100 mM KCl
[Na+] ͂ 30 mM mM
0,015
0,01
0,005
0
450
500
550
600
650
nm
CONCLUSIONI
Folding del DNAzima in presenza di diverse tipologie di
soluzioni, anche complesse (DMEM e surnatante cellulare);
Biosensore sensibile solo nell’intervallo 0 mM KCl – 0.5 mM
di KCl anche in presenza di altri ioni (es. [Na+] ͂ 30 mM) con
spettroscopia UV-VIS; con CD abbiamo differenze
significative tra 30 mM di KCl e 40 mM KCl con il solo Gquadruplex;
Sia il CD che la spettroscopia UV-VIS non rilevano differenze
di concentrazione di K+ tra DMEM trattato e surnatante
cellulare trattato;
Prospettive Future
Studio della sensibilità del biosensore attraverso aumento del
rapporto tra variazione del valore misurato e la variazione del
valore reale (concentrazione di K+) modificando la
concentrazione degli ioni Na+ e K+;
Calibrazione del biosensore
concentrazioni di lavoro
all’interno
del
Studio dettagliato del ruolo strutturale dello ione Na+
range
di