Luglio-Settembre 2013 • Vol. 43 • N. 171 • Pp. 149-157
Dismorfologia neonatale
Il neonato con anomalie congenite multiple:
inquadramento e nosologia
Giovanni Corsello, Mario Giuffrè, Maria Piccione
Dipartimento di Scienze per la Promozione della Salute e Materno Infantile, Università degli Studi di Palermo
Riassunto
L’approccio clinico e diagnostico al neonato con malformazioni congenite multiple prevede un’accurata analisi del fenotipo e delle informazioni anamnestiche sia pre- che post-concezionali, finalizzata alla scelta delle indagini di laboratorio (test citogenetici e molecolari) indispensabili per una corretta
identificazione nosologica.
Quadri clinici caratterizzati da anomalie congenite multiple possono essere sostenuti da alterazioni cromosomiche, genetiche ed epigenetiche, che non
sempre presentano un fenotipo caratteristico nelle epoche precoci della vita extrauterina. In tali situazioni l’apporto delle nuove tecniche di citogenetica e
genetica molecolare (array-CGH, next generation sequencing, etc.) può rivelarsi determinante per una precisazione etiologica e per una valutazione della
correlazione genotipo-fenotipo, anche in termini di evoluzione della storia naturale e di follow-up. Una corretta definizione diagnostica, inoltre, è il presupposto di una consulenza genetica alla famiglia, tesa alla identificazione di soggetti a rischio per la ricorrenza della condizione e alle opportunità di prevenzione
attraverso procedure di diagnosi preconcezionale o prenatale.
I gemelli costituiscono da sempre una popolazione peculiare e particolarmente interessante per comprendere i meccanismi responsabili dell’insorgenza di
patologie ed in particolare la relazione tra fattori genetici ed ambientali. La maggiore frequenza di patologia malformativa nei nati da gravidanza plurima
è ormai documentata e riconducibile a numerosi e complessi fattori. Recenti evidenze hanno però messo in luce il ruolo delle metodiche di procreazione
medicalmente assistita (e della Intra-Cytoplasmic Sperm Injection in particolare) nel determinare un ulteriore incremento della patologia malformativa
congenita, anche attraverso meccanismi epigenetici che interferiscono con i normali processi di imprinting genomico nei gameti e negli embrioni.
Summary
A clinical and diagnostic approach to a newborn with multiple congenital malformations requires an accurate analysis of the phenotype together with
gestational and preconceptional informations, in order to choose adequate laboratory investigations (cytogenetic and molecular tests) which may allow a
correct nosologic identification.
Multiple congenital malformations could be determined by chromosomal, genetic and epigenetic anomalies and the clinical presentation may not be characteristic in early stages of the postnatal life. New cytogenetic and molecular techniques (i.e. CGH array, next generation sequencing, etc.) may be useful to
evaluate identify etiology and genotype-phenotype correlation, natural history and follow-up of each patient. A correct diagnosis is the basis for adequate
genetic counselling to the family, for assessment of recurrence risk and for evaluation of preventive tools, such as preconceptional or prenatal diagnosis.
Twins have always represented a peculiar population, particularly interesting in order to understand the relation between genetic and environmental factors
in the pathogenesis of diseases. Higher prevalence of malformations in multiple pregnancies is well documented and is caused by a complexity of many
interacting factors. Recent evidences have demonstrated the role of assisted reproductive technologies (expecially Intra-Cytoplasmic Sperm Injection) as
independent factor in determining an additional increase of birth defect incidence, also through epigenetic mechanisms which may interfere with physiological processes of genomic imprinting in gametes and embryos.
Parole chiave: morfologia; malformazione; sindrome; sequenza; associazione; gemelli; epigenetica; imprinting; a-CGH; next generation sequencing
Key words: morphology; malformation; syndrome; sequence; association; twins; epigenetics; imprinting; comparative genomic hybridization; next generation sequencing
Metodologia della ricerca bibliografica
Inquadramento del neonato con anomalie congenite
La letteratura scientifica utilizzata è costituita sia da testi di riferimento multiple
nell’inquadramento clinico-diagnostico della patologia malformativa e
delle malattie genetiche che da articoli di aggiornamento circa l’avanzamento delle conoscenze nei settori specifici e le applicazioni delle
moderne indagini di laboratorio (utilizzando come motore di ricerca
Pubmed). È stata posta particolare attenzione al reperimento di fonti
bibliografiche accessibili gratuitamente on-line, di estrema importanza nell’ausilio all’inquadramento clinico-diagnostico.
La patologia malformativa complessa mostra un’elevata prevalenza
alla nascita (2-4% dei nati vivi) (WHO, 2012). Le malformazioni congenite sono responsabili di morbosità e mortalità nel periodo neonatale e rappresentano complessivamente in Italia la terza causa di
ospedalizzazione nei primi 4 anni di vita (Nicolosi, 2002). Esse sono
frequentemente caratterizzate da complessi quadri clinici con interessamento multi-organo e/o deficit funzionali multipli.
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G. Corsello, M. Giuffrè, M. Piccione
Tabella I.
Approccio diagnostico per il neonato con anomalie congenite multiple.
Anamnesi
FAMILIARE (stesura albero genealogico con informazioni relative agli aborti, alla morte endouterina, alla
mortalità perinatale, infantile e/o giovanile, alle malformazioni congenite, al ritardo psicomotorio, al ritardo
mentale, alla provenienza geografica ed all’eventuale consanguineità)
GRAVIDICA (malattie materne quali iperfenilalaninemia, patologie autoimmuni, diabete, infezioni, minacce di
aborto o parto pretermine,uso di farmaci, alcool, droghe, esposizione a radiazioni).
FETALE (inizio e tipo di attività fetale, crescita fetale)
PERINATALE (parametri auxologici in rapporto all’età gestazionale, ritardo/eccesso di crescita; analisi
del fenotipo,difetti strutturali singoli o multipli, minori e/o maggiori, e esame neuromotorio per valutare
l’eventuale presenza di deficit associati (ipotonia/ipertonia muscolare, deficit di suzione, difficoltà di
alimentazione, convulsioni, etc.)
Analisi del fenotipo
Esame dismorfologico
Ricerca malformazioni congenite
Screening malformativo ecografico, eventuali indagini radiologiche e di imaging
Diagnostica specialistica
- analisi molecolari del DNA
- cariotipo
- β-CGH
Molte patologie genetiche sono rare (prevalenza nella popolazione
generale <1/2.000) e pertanto la diagnosi può, a volte, essere difficile e tardiva. L’iter diagnostico è articolato e complesso per il sovrapporsi di tratti fenotipici simili in patologie differenti, e prevede diverse tappe dalla raccolta anamnestica alla diagnostica specialistica
(Tab. I). In particolare cardine del processo diagnostico è l’esame
dismorfologico (Tab. II). In senso cranio-caudale andrà descritto ogni
particolare con la corretta terminologia e seguendo le indicazioni, i
metodi e i criteri di riferimento più aggiornati e condivisi dalla comunità scientifica internazionale (Carey et al., 2012; Allanson et al.,
2009, Carey et al., 2009, Hall et al., 2009, Hunter et al., 2009, Hennekam et al., 2009, Biesecker et al., 2009, Hennekam et al., 2013).
L’osservazione di una o più alterazioni morfostrutturali di un organo,
un distretto o una regione corporea presenti alla nascita, talvolta
identificabili già nella vita intrauterina attraverso le metodiche di
diagnosi prenatale, conduce alla diagnosi di malformazione conge-
Tabella II.
Esame dismorfologico.
Crescita
Armonica/disarmonica, bassa/alta statura
Cranio
Microcefalia, macrocefalia, brachicefalia, dolicocefalia, scafocefalia, plagiocefalia, trigonocefalia, turricefalia, etc.
Suture e fontanelle: precoce/ritardata chiusura
Glabella: prominente, piatta, etc.
Capelli
Attaccatura alta/ bassa del capillizio, capelli radi, crespi, sottili, radi, etc.
Faccia
Piatta, grossolana, ipomimica, allungata, stretta, rotonda, vecchieggiante, triangolare, etc.
Fronte ampia, fronte stretta, prominente, sfuggente, con sutura metpoica prominente/depressa
Sopracciglia folte, rade, arcuate, orizzontali, allungate assenti, sinofri, etc.
Occhi infossati, buftalmo, fessure palpebrali strette, rime palbebrali orientaleggianti/antidown, epicanto, iper/ipotelorismo,
microftalmia, ancghiloblefaron, ectropion/entropion, etc.
Massiccio facciale prominente/ipoplastico, zigomi ipoplasici
Naso bulboso, piccolo, a becco, con ponte nasale depresso/prominente, con punta arrotondata, bifido, con setto più lungo delle ali,
narici slargate, narici antiverse, narice unica, etc.
Filtro nasale breve, lungo ipo/ipertrofico, profondo, etc.
Bocca ampia, piccola, angoli rivolti in basso, labbra sottili, carnose, labbro inferiore everso, gengive ipertrofiche, frenuli
sovrannunerari, palato ogivale, anomalie di forma e struttura dei denti, disodontiasi, macro/microglossia, etc.
Mandibola con prognatismo, micrognatia/retrognatia, schisi mandibolare, etc.
Padiglioni auricolari displasici, ampi, piccoli, a basso impianto, trago/antitrago bifido, assente, piatto, duplicato, elice/antelice piatto,
ipoplasico, appendici preauricolari, fistole preauricolari, etc.
Collo
Corto, tozzo, lungo, con cute retronucale sovrabbondante, pterigium colli, etc.
Torace
Stretto, lungo, pectus exavatum, pectus carinatum, asimmetrico con ipo/aplasia monolaterale dei muscoli pettorali, teletelia,
capezzoli introflessi, etc.
Arti
Ridotta mobilità, brevità rizo/mesomelica, arti lunghi, tibia vara, tibia valga, etc.
Mani/piedi
Sindattilia, brachidattilia, clinodattilia, esa/polidattilia, oligodattilia, camptodatttilia, etc.
Genitali esterni
Criptorchidismo, micropene, ipoplasia delle grandi e/o piccole labbra, genitali ambigui, ipospadia, etc.
Cute
Spessa, macchie ipocromiche, nevi, macchie caffè e latte, angiomi, etc.
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Il neonato con anomalie congenite multiple: inquadramento e nosologia
Tabella III.
Classificazione clinica dei difetti morfostrutturali.
Tabella IV.
Classificazione etiologica delle malformazioni congenite.
Malformazioni maggiori
Primarie (da causa genetica)
Alterazioni morfostrutturali che determinano
un’alterazione di una funzione tale da assumere una rilevanza clinica o estetica che necessiti di trattamento medico e/o chirurgico.
Malformazioni minori
Alterazioni morfostrutturali meno rilevanti
sul piano clinico o estetico, che non alterano
alcuna funzione e non necessitano quindi di
alcun trattamento, presenti in meno del 4%
della popolazione di riferimento.
Varianti fenotipiche
Alterazioni morfostrutturali meno rilevanti
sul piano clinico o estetico, che non alterano
alcuna funzione e non necessitano quindi
di alcun trattamento, presenti con una frequenza superiore al 4% nella popolazione di
riferimento.
nita. Ciò deve rappresentare l’avvio di un percorso teso all’identificazione di altre possibili anomalie congenite in altri organi e apparati
(anche non immediatamente emergenti sul piano clinico), alla definizione della rilevanza clinica delle stesse (malformazioni maggiori
e minori, tab. III), alla identificazione della base etiologica (malformazioni primarie e secondarie, tab. IV) e del possibile meccanismo
patogenetico (sindromi, sequenze, associazioni, tab. V) (Corsello e
Giuffrè, 2012). Si tratta di un percorso talvolta lungo e difficile, che
rende spesso necessario un follow-up a lungo termine per cogliere
la possibile emergenza di caratteristiche fenotipiche nelle epoche
successive, che possono più correttamente indirizzarne l’inquadramento nosologico. La diagnosi corretta e l’identificazione etiologica
consentono inoltre una corretta valutazione del rischio di ricorrenza
e un’adeguata consulenza genetica alla coppia.
Le malformazioni primarie, difetti della morfogenesi frutto di un
errore intrinseco del processo di sviluppo presente sin dal concepimento, possono scaturire da un’ampia gamma di alterazioni cromosomiche numeriche e strutturali, mutazioni geniche e alterazioni
epigenetiche (Tab. IV). Ogni giorno diversi gruppi di ricerca arricchiscono il patrimonio di informazioni della comunità scientifica internazionale con l’identificazione di nuove mutazioni e nuovi meccanismi genetici responsabili di insorgenza di patologie. Le banche dati
informatizzate vengono quindi periodicamente aggiornate e rese
disponibili attraverso il web.
Le malformazioni secondarie a noxae patogene non genetiche possono riconoscere cause biologiche, metaboliche, chimiche, fisiche,
meccaniche (Tabb. IV e VI). Una compressione meccanica esercitata
dalle pareti della camera gestazionale (per sovraffollamento – vedi
gemellarità –, per difetti anatomici o per masse occupanti spazio
quali fibromi uterini) ovvero da bande mesodermiche aberranti di
origine coriale può determinare una deformazione del feto. La formazione di briglie amniotiche può essere determinata da traumi,
amniocentesi ripetute o anomalie del tessuto connettivo e può innescare la sequenza da rottura precoce dell’amnios, con un corteo
fenotipico ampio e complesso denominato limb body wall complex.
I quadri clinici con malformazioni multiple possono essere classificati in modo diverso in base al tipo di relazione esistente tra le
diverse anomalie congenite che li compongono: relazione etiologica, patogenetica, di sede, di derivazione embriologica, di timing di
insorgenza nella vita embriofetale (Tab. V, Wiedemann et al., 1992;
Donnai e Winter, 1995; Jones, 1997; Twinning et al., 2000). Ad
esempio l’osservazione di due o più segni dismorfici facciali e/o di
Aberrazioni cromosomiche
o numeriche
§ poliploidia
§ polisomia
§ monosomia
o strutturali
§ delezioni
§ duplicazioni
§ inserzioni
§ traslocationi
Monogeniche
o mutazioni puntiformi
§ nonsense
§ missense
§ frameshift
o mutazioni dinamiche
§ amplificazione delle triplette
o regolazione epigenetica
§ alterazioni dell’imprinting
§ disomia uniparentale
Poligeniche
Secondarie (da causa ambientale)
Agenti biologici
o virus
§ citomegalovirus
§ rosolia
§ herpes virus
o batteri
§ treponema pallidum
o parassiti
§ toxoplasma gondi
Agenti chimici
o farmaci
§ antiblastici
§ anticonvulsivanti
§ antibiotici
o sostanze da abuso
§ alcohol
§ fumo
§ cocaina
§ oppiacei
o condizioni metaboliche
§ iperglicemia, iperinsulinemia
§ iperfenilalaninemia
§ iperandrogenismo
Agenti fisici
o radiazioni ionizzanti
o radiazioni elettromagnetiche
Disruptions vascolari
o disruption dell’arteria succlavia
o twin-twin disruption sequence
Cause meccaniche (deformazioni)
o bande amniotiche
o gemellarità
o oligoidramnios
o malformazioni uterine
o tumori uterini
anomalie delle mani associate a malformazioni maggiori e/o ritardo
neuromotorio (Fig. 1) deve far sospettare la presenza di una sindrome cromosomica o genetica.
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G. Corsello, M. Giuffrè, M. Piccione
Tabella V.
Classificazione dei quadri polimalformativi.
Tabella VI.
Principali disruptions determinate da agenti biologici e chimici.
Sindromi
Agente biologico
Sequenze
Associazioni
Difetti congeniti multipli che riconoscono una causa
unica, di per sé necessaria e sufficiente per determinare il quadro polimalformativo, indipendentemente
dal coinvolgimento di organi e tessuti fisicamente
lontani e distinti da un punto di vista embriologico e
patogenetico. Per un quadro sindromico definito, la
causa può essere sia un’alterazione genetica che una
noxa ambientale, che ha agito su più campi di sviluppo durante l’embriogenesi.
Quadri polimalformativi determinati da una cascata
di processi dismorfogenetici, collegati tra loro da un
meccanismo di causa ed effetto. L’evento iniziale può
variare da un individuo all’altro, ma si caratterizza
sempre per la capacità di innescare un meccanismo
a cascata ed indurre un corteo di difetti secondari,
cronologicamente e patogeneticamente correlati.
Condizioni caratterizzate dalla compresenza nello
stesso individuo di più anomalie congenite apparentemente non correlate, né etiologicamente né patogeneticamente, ma associate tra loro con una frequenza superiore alla semplice probabilità statistica.
Talvolta sono riconducibili ad anomalie della blastogenesi, riconoscono cioè il timing di azione della noxa
patogena, in un’epoca così precoce in cui l’embrione
si comporta come un campo di sviluppo unico.
Figura 1.
Associazione di tratti dismorfici facciali (fronte prominente, ipertelorismo, occhi infossati, naso bulboso prominente, micrognatia, labbra carnose, labbro inferiore everso, padiglioni auricolari displasici con antelice
prominente, lobuli auricolari ampi, collo corto) ed anomalie dei piedi
(solchi plantari profondi) in neonato con trisomia 8 in mosaico.
Le sindromi più frequenti e più note sono quelle determinate da
anomalie cromosomiche numeriche o strutturali (sindrome di Down,
Edwards, Patau, Turner, cri du chat, etc.). Sebbene molte di esse
siano state descritte già da anni, ancora molte informazioni sono
necessarie per definire in modo più preciso le regioni cromosomiche
critiche responsabili, studiare i geni in esse presenti e le complesse
interrelazioni e regolazioni della loro espressione, spesso responsabili di un’ampia variabilità nella relazione genotipo-fenotipo.
Numerose sono anche le più note sequenze malformative descritte
in letteratura (Tab. VII), tra le quali la sequenza di Potter, nella quale
una primitiva anomalia di sviluppo dell’apparato urinario (quale ad
esempio l’agenesia renale bilaterale), sia essa da causa genetica o
ambientale, determina conseguentemente oligo-anuria, oligoidramnios, deformazioni da compressione nella camera gestazionale, ipoplasia polmonare, distress respiratorio alla nascita.
Alcune associazioni malformative sono identificate attraverso acronimi costituiti dalle iniziali dei singoli difetti congeniti che le compongono, come l’associazione VACTERL (Veterbral defects, Anorectal
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Fenotipo
Citomegalovirus
• microcefalia, calcificazioni intracraniche, ritardo psicomotorio, ipoacusia neurosensoriale,
corioretinite, epatosplenomegalia, trombocitopenia, presenza del virus nelle secrezioni e nei
fluidi biologici (urine).
Rosolia
• microcefalia, ritardo psicomotorio, cataratta
congenita, ipoacusia neurosensoriale, cardiopatie congenite, alterazioni ematologiche
(anemia, trobocitopenia).
Varicella-Zoster
• ritardo mentale, atrofia corticale, convulsioni,
corioretinite, cicatrici cutanee.
Treponema Pallidum
• pemphigo palmoplantare, esantema con cicatrici cutanee, anemia, trombocitopenia, epatosplenomegalia, miocardite, corioretinite, rinite
mucoematica, alterazioni scheletriche (lacune, caput quadratum, difetti di ossificazione
metafisaria, osteocondriti e pseudoparalisi
secondarie).
Toxoplasma Gondi
• idrope, idrocefalo, calcificazioni intracraniche,
corioretinite, cataratta, convulsioni, epatosplenomegalia, rash cutaneo.
Agente chimico
Fenotipo
Farmaci
anticonvulsivanti
• labiopalatoschisi, difetti del tubo neurale, cardiopatie congenite
• idantoina (microcefalia, ritardo mentale, anomalie del SNC, naso piccolo, ipoplasia dello
splancnocranio, epicanto, ipertelorismo, strabismo, labiopalatoschisi, micrognazia, collo
corto, cardiopatie).
• trimetadione (microcefalia, ipoplasia dello
splancnocranio, sinofri palpebrali, epicanto,
displasia dell’orecchio esterno, difetti urogenitali, cardiopatie).
• acido valproico (trigonocefalia, ridotto diametro bitemporale, ipoplasia dello splancnocranio, naso piccolo, labiopalatoschisi, difetti
urogenitali e degli arti).
Alcool
• IUGR, facies peculiare (microcefalia, rime palpebrali corte, naso piccolo con narici anteverse, filtro nasale ipoplasico, microretrognazia)
anomalie neurologiche (ipotonia, convulsioni,
scarsa coordinazione motoria, ritardo mentale).
Cocaina
• prematurità, IUGR, microcefalia, malformazioni urogenitali e scheletriche.
Eroina
• IUGR, basso peso alla nascita, malformazioni
congenite.
Diabete materno
• macrosomia, ipoglicemia, ipocalcemia, ipertrofia del setto interventricolare, disgenesia
caudale, ogni tipologia di malformazioni congenite (scheletriche, cardiache, renali, intestinali, del SNC, etc.).
Iperfenilalaninemia
materna
• difetti di proliferazione e migrazione cellulare
con ritardo di mielinizzazione (IUGR, microcefalia grave, ipotelorismo, naso prominente, displasia dei padiglioni auricolari a basso
impianto, ritardo mentale, labiopalatoschisi,
cardiopatie conotruncali).
IUGR: Intrauterine growth restriction.
Il neonato con anomalie congenite multiple: inquadramento e nosologia
Tabella VII.
Principali sequenze malformative.
Denominazione/eponimo
Campo di sviluppo ed organi interessati
Oloprosencefalia
mesoderma precordiale, vescicola prosencefalica, rinencefalo, orbite, naso, premaxilla
Displasia setto-ottica
chiasma ottico, ipofisi
Pierre Robin
mandibola, regione oro-faciale
Poland
muscolo pettorale, arto superiore
Klippel-Feil
rachide
Potter
reni, vie urinarie, polmoni, arti, facies
Prune belly
vie urinarie, parete addominale
Estrofia della vescica e della cloaca
mesoderma peri-ombelicale
Rokitansky
dotti di Muller
Sirenomelia
mesoderma caudale
Regressione caudale
mesoderma caudale
Rottura premature dell’amnios
asse mediano, deformazioni degli arti, schisi faciali
Acinesia fetale
multipli distretti corporei
Twin-twin disruption sequence
multipli distretti corporei
atresia, Cardiac anomalies, Tracheoesophageal fistula, Esophageal
atresia, Renal anomalies, Limb defects) (La Placa et al., 2013). Nel
gruppo delle associazioni si possono trovare condizioni polimalformative rare di difficile inquadramento dal punto di vista etiopatogenetico per una insufficiente mole di informazioni disponibili. Qualora venisse identificata la causa etiologica responsabile del quadro
polimalformativo sarà quindi necessario modificare l’inquadramento
nosologico, come accaduto per l’associazione CHARGE oggi ridefinita sindrome CHARGE (Coloboma, Difetti cardiaci, Atresia delle coane,
Ritardo di crescita e sviluppo, Ipoplasia dei genitali, Anomalie delle
orecchie/Sordità) in seguito all’identificazione del locus genico responsabile (Aramaki et al., 2006).
Test genetici: genetica molecolare e citogenetica
In un neonato con anomalie congenite multiple la diagnosi può essere “gestaltica” (quadro clinico evocativo per sindrome nota) con un
approccio diagnostico immediato (es. sindrome di Down, sindrome
di Williams, acondroplasia, etc.) e di conseguenza le indagini di laboratorio sono mirate, [cariotipo per la sindrome di Down, citogenetica molecolare mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH) della
regione 7q11.23 per la sindrome di Williams (Brewer et al., 1996),
analisi molecolare del DNA per il gene FGFR3 per l’acondroplasia
(Heuertz et al., 2006)], ma talvolta il fenotipo non è evocativo di
una sindrome nota, anche se ascrivibile al cosiddetto chromosomal
phenotype (Devriendt et al., 2004). In tali situazioni fondamentale è
l’apporto delle tecniche di ibridazione genomica comparativa (arrayCGH) (Shaw-Smith et al., 2004, Edelmann et al., 2009).
I riarrangiamenti cromosomici criptici sono sempre più indicati
come causa sia di sindromi plurimalformative complesse che di ritardo mentale associato o no a tratti dismorfici, tanto da diventare
la prima indagine genetica da effettuare in entrambi i casi (Girirajan
et al., 2012).
L’introduzione nella citogenetica diagnostica di microarray con una
risoluzione 44 kb ha permesso di effettuare l’inquadramento etiologico in un numero crescente di pazienti. I sempre più numerosi
dati provenienti dagli array-CGH porteranno presto all’epilogo della
citogenetica classica ed all’inizio di una nuova citogenetica, sia per
quanto riguarda l’epidemiologia che per la natura dei riarrangiamenti cromosomici. Questa tecnica potrebbe diventare un mezzo
per colmare l’attuale gap fra la conoscenza della sequenza del genoma umano (e dei geni in essa contenuti) e la funzione dei geni
stessi: è evidente che qualunque delezione/duplicazione de novo
associata ad una specifica malformazione o sindrome suggerisce
che fra i geni localizzati nella regione sbilanciata almeno uno sia
responsabile, per aploinsufficienza o per eccesso di dose, di quella
malformazione o di quella sindrome (Sanders et al., 2011; Piccione
et al., 2011). Altre indagini andranno poi effettuate per definire il
ruolo, durante l’embriogenesi o nella funzione di quel certo organo,
dei geni coinvolti nell’alterazione criptica.
Gli array-CGH offrono possibilità diagnostiche:
• nei pazienti con riarrangiamenti cromosomici apparentemente
bilanciati e fenotipo patologico per evidenziare eventuali anomalie (microdelezioni/microduplicazioni) correlate alla patologia;
• nei pazienti con fenotipo orientativo per patologia cromosomica
e cariotipo standard normale;
• nei pazienti con segni orientativi per patologie note associate a
microalterazioni cromosomiche, ma con FISH con sonde locusspecifiche negative, per evidenziare microdelezioni o duplicazioni diverse;
• nei pazienti con malformazioni congenite e/o tratti dismorfici e
ritardo mentale di origine non identificata;
• nella ricerca del gene candidato per patologie note ad etiologia
sconosciuta.
Gli array-CGH non riescono ad evidenziare anomalie cromosomiche criptiche bilanciate, mentre possono identificare sia loci di
suscettibilità (per autismo, patologie neurodegenerative, patologie
psichiatriche etc.) che anomalie di cui non si conosce se correlate
a fenotipo patologico; queste ultime condizioni pongono importanti
problemi interpretativi in diagnosi prenatale.
Grazie alle tecniche di citogenetica molecolare e successivamente
agli array-CGH è stato possibile definire, inoltre, il ruolo dei markers
cromosomici soprannumerari nelle anomalie congenite multiple
(Callen et al., 1991). I markers sono piccoli cromosomi soprannu-
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merari (SMCs), strutturalmente anomali, che si riscontrano nello
0,043% dei nati vivi e nello 0,075% in diagnosi prenatale e possono
essere familiari (23%, di cui 16% di origine materna e 7% di origine paterna) o “de novo” (77%) (Reddy et al., 2013). I markers “de
novo” si associano ad un aumentato rischio di anomalie fenotipiche
(10-20%).
La maggior parte dei markers deriva da riarrangiamenti nella regione pericentrica di cromosomi acrocentrici, per cui i markers cromosomici soprannumerari sono più spesso costituiti da materiale
centromerico, eterocromatina costitutiva e satelliti; e non si associano a manifestazioni fenotipiche. In altri casi (30%) nel contesto del
cromosoma marker, è possibile riscontrare anche eucromatina, con
implicazioni sul fenotipo. La definizione accurata della regione cromosomica coinvolta nella formazione del marker è necessaria per
la correlazione cariotipo/fenotipo, utile per il follow-up dei pazienti e
per la consulenza genetica.
Particolare interesse ha suscitato, infine, il riscontro tramite arrayCGH di patologie caratterizzate dal coinvolgimento della stessa regione cromosomica, che si presenta rispettivamente deleta o duplicata Alla base di tali patologie c’è la presenza, nel genoma umano, di
dupliconi o duplicazioni segmentali. I dupliconi sono blocchi di poche
sequenze genomiche ripetute (Low Copy Repeats, LCRs) con omologia reciproca di oltre il 90% (Sharp et al., 2006), presenti in segmenti cromosomici non omologhi, di dimensioni comprese tra 200
e 400 kb. Tali regioni rappresentano circa il 6% del genoma umano
e sono intersperse in tutto il genoma, ma maggiormente rappresentate nelle regioni pericentromeriche, telomeriche e subtelomeriche.
Possono comprendere numerosi geni, ma anche pseudogeni tronchi
non processati. I dupliconi spesso sono duplicati nell’ambito nella
stessa regione cromosomica a distanza reciproca di poche megabasi (meno di 10 Mb) e mediano un’eventuale ricombinazione omologa
non allelica alla meiosi (non allelic homologus recombination, NAHR)
tra cromosomi o tra cromatidi fratelli; ciò può determinare crossingover ineguale e riarrangiamenti cromosomici ed è alla base, quindi, di frequenti e specifici meccanismi di anomalie cromosomiche
strutturali come microdelezioni o microduplicazioni (copy number
variants, CNVs), ma anche traslocazioni, inversioni e cromosomi
marcatori (Hastings et al., 2009). Le microdelezioni sono più frequenti delle microduplicazioni. Una microdelezione può infatti originare da una più ampia gamma di meccanismi di ricombinazione:
può essere intracromatidica, intercromatidica o intracromosomica,
mentre una microduplicazione origina solo da una ricombinazione
intercromatidica o intracromosomica (Neri e Genuardi, 2010).
Le patologie caratterizzate dal coinvolgimento della stessa regione
cromosomica si manifestano con fenotipo diverso e nella maggior
parte dei casi il fenotipo correlato alla microdelezione è più grave
(sindrome di Di George/Velocardiofaciale e sindrome da duplicazione 22q11.2, rispettivamente delezione e duplicazione della regione
22q11.2; sindrome di Smith-Magenis e sindrome di Potocki-Lupski,
rispettivamente delezione e duplicazione della regione 17p11.2;
sindrome da delezione/ duplicazione 16p11.2; sindrome di Williams
da delezione 7q11.23 e sindrome da duplicazione della regione
7q11.23, etc).
Negli ultimi anni un ulteriore impulso alla identificazione di nuove
mutazioni responsabili di malattie rare è stato possibile con il superamento della classica tecnica di sequenziamento tipo Sanger
e la messa a punto nei più avanzati laboratori di ricerca di nuove
tecniche di sequenziamento. L’exome sequencing (ES) consente il
sequenziamento dei soli esoni (circa 200.000) (Coonrod et al., 2013)
ed oggi si sta valutando la possibilità di sfruttare questa tecnica
come metodica diagnostica vera e propria. Recentemente l’ES è ap-
154
parso come un’utile alternativa alla classica diagnosi di malattie che
presentano eterogeneità genetica e fenotipica. Oggi queste patologie vengono confermate mediante PCR e sequenziamento Sanger
di ogni gene coinvolto, ma questo approccio risulta molto laborioso, costoso e poco tempestivo nel caso sia necessaria una rapida
diagnosi. Con l’ES è invece possibile valutare solo gli esoni (Whole
Exome Sequencing, Next Generation Sequencing-NGS) e non tutta
la sequenza dei geni, riducendo così la mole di dati di output e rendendo la procedura diagnostica più veloce. La NGS trova indicazione
oltre che nelle sindromi ad eterogeneità genetica e fenotipica (Ng et
al., 2010, Paulussen et al., 2011) anche nelle malattie mendeliane
(Bamshad et al., 2011, Ku et al., 2012) ed in particolare quelle in cui
vi è un limitato numero di soggetti affetti per famiglia (Hoischen et
al., 2010).
La grande mole di informazioni che emerge dall’ES ha dato vita anche a numerose questioni di tipo etico. Infatti spesso si riscontrano
delle alterazioni in maniera accidentale, mentre ci si sta focalizzando su diverse regioni genomiche, e può succedere che queste
predispongano a determinate patologie, anche in futuro. Dibattuto
è, pertanto, se sia lecito informare il paziente qualora l’alterazione
casualmente riscontrata non sia correlata allo scopo principale del
test per cui il soggetto ha prestato il proprio consenso. Ancora più
complesso è il caso in cui venga rilevata in modo accidentale una
mutazione di cui non si conosce l’effetto, né immediato né futuro.
Ulteriori ausili diagnostici nel prossimo futuro potranno scaturire dagli studi di proteomica e metabolomica. La proteomica è la scienza
che mira ad indagare e stabilire l’identità, la quantità, la struttura e
le funzioni biochimiche e cellulari di tutte le proteine presenti in un
tessuto, in una cellula o in un comparto sub-cellulare, descrivendo
come queste proprietà siano variabili nello spazio, nel tempo o in un
determinato stato fisiologico (Tyers e Mann, 2008). La metabolomica
studia le alterazioni delle funzioni metaboliche dei sistemi biologici
mediante tecniche spettroscopiche applicate. La proteomica, unitamente ad altre metodiche di indagine complementari (genomica,
microarray, metabolomica) costituisce il componente essenziale di
una nuova ed emergente tipologia di studio, indicata come Systems
Biology. Quest’ultima, tramite analisi sistematiche e quantitative di
tutti i componenti di un sistema biologico, si prefigge di definirne
estensivamente i sistemi che sono alla base del suo funzionamento
(Miernyk e Thelen, 2008).
Imprinting ed epigenetica
L’analisi del fenotipo può evocare una sindrome da alterazione epigenetica (sindrome di Beckwith-Wiedemann, Sindrome di PraderWilli, Sindrome di Angelman, etc.).
Per epigenetica s’intende il complesso di meccanismi che regolano
l’attività genica senza modificare la sequenza nucleotidica del DNA
e che sono trasmessi ereditariamente nel corso delle generazioni. In
contrasto con il genoma di ogni individuo che è determinato per tutte
le cellule somatiche al momento del concepimento, l’“epigenoma”
è estremamente dinamico e differisce da tessuto a tessuto. Con il
termine “imprinting genomico” s’intende l’espressione differenziata di materiale genetico, a seconda che esso derivi dal genitore di
sesso maschile oppure dal genitore di sesso femminile (Brannan et
al., 1999). Ovvero, mentre la maggior parte dei geni si esprime in
modo biallelico, i geni imprinted hanno espressione monoallelica e
l’allele espresso dipende dall’origine parentale (Ferguson-Smith e
da Rocha, 2004). Questo fenomeno di regolazione genica è tipico dei
mammiferi e di alcune piante e contraddice l’assioma mendeliano,
secondo il quale l’origine dell’informazione genetica non influenza
Il neonato con anomalie congenite multiple: inquadramento e nosologia
l’espressione dei geni. Le variazioni epigenetiche di maggior impatto
sull’espressività genica si verificano durante la riprogrammazione
genomica nella gametogenesi e nell’embriogenesi precoce (Brannan e Bartolomei, 1999, Portela e Esteller, 2010). La metilazione del
DNA rappresenta la modifica epigenetica più caratteristica dei loci
imprinted. Questo “marchio” epigenetico, in associazione ad altre
modifiche chimiche degli istoni, determina, infatti, l’attivazione di
una copia genica e la repressione dell’altra e dunque, a seconda del
tipo di gene imprinted, solo l’allele di origine materna o solo quello
di origine paterno sarà attivo nella progenie. Il fenomeno dell’imprinting determina pertanto la non equivalenza di espressione dei
genomi materno e paterno. La sequenza nucleotidica dei due alleli
di un gene imprinted è perfettamente identica; ciò che consente alle
cellule di distinguere i due alleli di diversa origine parentale è di natura epigenetica e quindi reversibile ed ereditabile. Fino ad oggi sono
stati identificati oltre 80 geni imprinted nel genoma umano, ma si
stima globalmente ne esistano circa 1000, raramente isolati, l’80%
fisicamente raggruppati in cluster. Elementi di controllo dell’imprinting agiscono influenzando gli elementi regolatori gene-specifici (ad
esempio i promotori) determinando l’attivazione o la repressione dei
geni imprinted del cluster (Reik et al., 2001).
Le sindromi da alterazione epigenetica si possono collegare con
anomalie dell’“imprinting genomico” (Ferguson-Smith e Surani,
2001). Nel caso di sindrome con alterazione epigenetica, quindi, non
si avrà un evento mutazionale del DNA, ma piuttosto una anomalia
funzionale che altera le funzioni dei geni sottoposti ad imprinting
(disomia uniparentale per loci cromosomici sottoposti ad imprinting,
anomalia del centro di imprinting etc.) e che darà fenotipi diversi in relazione alle regioni cromosomiche interessate (sindrome di
Beckwith-Wiedemann per la regione cromosomica 11p15.5, sindrome di Prader-Willi per la regione cromosomica 15q11.2-q13 paterna, sindrome di Angelman per la regione cromosomica 15q11.2-q13
materna, etc.) (Gunay-Aygun et al., 2001, Fridman et al., 2000).
Le malformazioni nei gemelli
Lo studio dei gemelli ha da sempre suscitato particolare interesse
per l’opportunità di valutare il ruolo di fattori genetici e ambientali
nello sviluppo delle caratteristiche fenotipiche (Galton, 1875). È stato
evidenziato da diversi ampi studi e dall’analisi dei dati dei registri
internazionali delle malformazioni congenite (ICBDMS) che nei nati
da gravidanza plurima l’incidenza di anomalie congenite è maggiore
rispetto ai nati singoli (Mastroiacovo et al., 1999), per la maggior
parte ascrivibile ai gemelli monozigotici (MZ) mentre nei gemelli dizigotici (DZ) non differisce in modo significativo rispetto ai nati singoli (Corsello, 2010).
Tra le anomalie congenite più frequenti nei gemelli, e in particolare nei gemelli MZ, vi sono certamente i difetti della linea mediana,
le cardiopatie congenite, i difetti del tubo neurale e del canale gastrointestinale, i difetti della parete addominale, i difetti in riduzione
degli arti (Giuffrè et al., 2011). La patologia malformativa che si può
osservare nei nati da gravidanza plurima è quindi molto eterogenea sotto il profilo clinico ed etiopatogenetico, includendo condizioni
analoghe ai nati singoli ed altre peculiari delle gravidanze multiple.
Classicamente sono state descritte nei gemelli malformazioni da
causa genetica, alterazioni della blastogenesi, disruptions vascolari
e deformazioni.
La presenza di più feti in una gravidanza plurima pone inoltre il
problema della valutazione del grado di concordanza fenotipica. Si
considerano concordanti i gemelli che presentano la stessa malformazione e discordanti quando uno solo presenta difetti morfoge-
netici ovvero entrambi presentano anomalie congenite, distinguibili
però sotto il profilo clinico ed embriologico. Il tasso di concordanza
varia ampiamente in relazione al tipo di gravidanza gemellare (MZ
vs DZ) e all’etiopatogenesi della malformazione (causa genetica vs
ambientale, anomalie della blastogenesi, disruptions vascolari, etc.).
I gemelli MZ sono concordanti dal punto di vista del sesso e delle
caratteristiche fenotipiche, tuttavia la piena concordanza del 100%
può risultare esclusivamente teorica in relazione a possibili differenze genotipiche o al ruolo di fattori ambientali con modalità e in momenti diversi sui due gemelli. Il prototipo di discordanza fenotipica
per malformazioni tra gemelli MZ è rappresentato dalle disruptions
vascolari che determinano un’assoluta discordanza per caratteristiche fenotipiche e prognosi. La discordanza tra i gemelli per una
malformazione congenita, specie se letale o gravemente invalidante,
pone seri problemi di ordine bioetico e psicologico alla coppia e alla
équipe sanitaria. È aperto il dibattito in letteratura circa le opzioni più
valide nel management di tali gravidanze (attesa, interruzione volontaria, riduzione selettiva, trattamenti in utero, etc.), laddove occorre
prendere in considerazione le diverse variabili e fornire un adeguato
counselling e sostegno psicologico alla coppia.
Lo sviluppo di metodiche di procreazione medicalmente assistita
nel corso delle ultime 3 decadi ha profondamente modificato l’epidemiologia delle gravidanze plurime, determinandone un sensibile
aumento di incidenza. Una crescente attenzione viene oggi dedicata
al possibile ruolo di tali metodiche nell’insorgenza di anomalie congenite, seppur difficile da valutare in considerazione dei numerosi
fattori confondenti (prevalenza di gravidanze plurime, età e parità
della donna, abitudini e stili di vita, modalità di follow-up, etc.). Tuttavia solo negli ultimi anni è stato possibile estrapolare e documentare
un aumento di rischio per anomalie congenite nei nati da tecniche
di fecondazione in vitro, costruendo modelli di studio metodologicamente più corretti e riproducibili, ampliando le casistiche reclutate
anche con l’ausilio dei registri per le malformazioni congenite e uniformando programmi di follow-up e criteri diagnostici (Hansen et al,
2002; Hansen et al., 2013). Tale incremento risulta essere estremamente variabile nelle diverse casistiche e secondo il tipo di anomalia
considerata. Numerosi fattori sembrano contribuire, sia intrinseci
alla coppia con ipofertilità che legati alla metodica di procreazione
medicalmente assistita (PMA) utilizzata. In particolare, con la sempre maggiore diffusione dell’ICSI (intracytoplasmic sperm injection),
un ruolo significativo è stato attribuito all’assenza di selezione naturale del gamete maschile. Più recentemente è stata evidenziata la
possibilità che la manipolazione e conservazione dei gameti e degli
embrioni, che si verifica con la PMA, interferisca con meccanismi
epigenetici essenziali per le tappe precoci dello stadio preimpianto e
per il corretto sviluppo dell’embrione e del feto (Lucifero et al., 2004,
Niemitz e Feinberg, 2004). Le condizioni di conservazione e coltura di gameti ed embrioni possono determinare modificazioni della
metilazione del DNA e della struttura della cromatina, aumentando
così il rischio di patologie riconducibili ad alterata espressione di
geni sottoposti ad imprinting. È stato infatti dimostrato un incremento di prevalenza di sindrome di Beckwith-Wiedemann per deficit di
metilazione dell’allele materno in regione 11p15 nei nati con PMA
(Weksberg et al., 2010). Questa e altre osservazioni hanno rafforzato la consapevolezza che le metodiche PMA possono determinare
un maggior rischio di anomalie congenite, anche attraverso meccanismi epigenetici, meritevole di ulteriori verifiche e conferme. Le
coppie che accedono a queste metodiche devono essere quindi adeguatamente informate e deve essere offerto loro un percorso che
preveda analisi genetiche, counselling preconcezionale e accurato
follow-up della gravidanza.
155
G. Corsello, M. Giuffrè, M. Piccione
Box di orientamento
Cosa si sapeva prima
L’inquadramento clinico e diagnostico del neonato con anomalie congenite multiple è un processo complesso, che può avviarsi già in epoca prenatale e
completarsi ben oltre il periodo neonatale, coinvolgendo numerosi diversi specialisti (ginecologo/ostetrico, ecografista, pediatra/neonatologo, genetista
clinico, etc.).
Banche dati elettroniche, cataloghi ed atlanti informatizzati ed altri moderni strumenti di ausilio alla diagnosi sono oggi disponibili per aiutare il clinico
nell’orientamento diagnostico, necessario per avviare un trattamento appropriato e un counselling mirato.
Il training e l’esperienza nel descrivere accuratamente il fenotipo e riconoscere eventuali alterazioni dello sviluppo morfostrutturale sono il requisito
essenziale per orientare e guidare la diagnostica clinico-strumentale e indirizzare le indagini di laboratorio finalizzate all’identificazione del difetto
responsabile del quadro polimalformativo.
Cosa si sa adesso
Il potenziale delle moderne indagini di laboratorio di citogenetica e genetica molecolare (array-CGH, sequenziamento genico, next generation sequencing, …) è in continuo rapido accrescimento, con progressiva diffusione delle stesse e incremento dell’accuratezza diagnostica. Tale processo necessita però di essere continuamente guidato ed indirizzato dall’esperienza del clinico per una adeguata interpretazione dei risultati.
Lo studio dei gemelli e dei nati da metodiche di procreazione medicalmente assistita ha consentito di identificare nuovi meccanismi che possono
determinare alterazioni nel prodotto del concepimento, in particolare alterazioni epigenetiche e dell’imprinting genomico.
… e nel prossimo futuro
L’insieme delle informazioni ottenute dagli studi di proteomica e metabolomica, correlate ed implementate con quelle provenienti dallo studio del genoma, potranno consentire di delineare e/o identificare estensivamente il ruolo effettivo delle proteine e della loro interazione, per una sempre maggiore
comprensione della correlazione genotipo-fenotipo.
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Corrispondenza
Giovanni Corsello, Dipartimento di Scienze per la Promozione della Salute e Materno Infantile, Università degli Studi di Palermo, Via Alfonso Giordano,
3 – 90127 Palermo. Tel.: +39 091 6555425. Fax: +39 091 6555423. E-mail: [email protected]
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