PROTEINE RICOMBINANTI:
ASSORBIMENTO
Via di somministrazione
preferenziale è generalmente
parenterale (i.v., i.m., i.p., s.c.)
La diversa via parenterale può
variare l’attività terapeutica
(irrorazione sanguigna, passaggio
nel sistema linfatico, ecc.)
PROTEINE RICOMBINANTI:
ASSORBIMENTO
Via di somministrazione orale non
valida se richiesta una elevata
biodisponibilità (degradazione e
scarsa permeabilità nel tratto G.I.)
Via “accessibile” per vaccini orali
(placche del Payer)
PROTEINE RICOMBINANTI:
ASSORBIMENTO
Vie alternative di somministrazione:
naso, polmoni, retto, cavità orale,
pelle
Problema
scarsa
biodisponibilità a cui si tenta di
ovviare aumentando l’assorbimento
senza dare tossicità
PROTEINE RICOMBINANTI:
ASSORBIMENTO
Aumento permeabilità barriere:
acidi grassi, sali biliari, saponine;
liposomi.
Riduzione attività peptidasica: inibitori
delle proteasi, modificazione struttura.
Aumento tempo di esposizione:
nanoparticelle (PEG, liposomi).
Effetto del glicocolato su biodisponibilità:
somministrazione nasale
Molecola AA
Biodisponibilità %
senza
con
Glucagone
29
<1
70-90
calcitonina
32
<1
15-20
insulina
51
<1
10-30
PROTEINE RICOMBINANTI:
BIODISPONIBILITA’
Targeting specifico:
particolato colloidale (liposomi,
microsfere di albumina, LDL ecc.).
Liposomi sono i più usati per bassa
tossicità, flessibilità, ampio “core”
acquoso)
PROTEINE RICOMBINANTI:
BIODISPONIBILITA’
Targeting “passivo”: fegato e milza
Targeting “attivo”: veicolazione con
ab specifici
Prolungamento emivita: pegilazione
(< att. biologica)
PROTEINE RICOMBINANTI:
DISTRIBUZIONE
Il volume di distribuzione è
generalmente modesto (scarsa
penetrazione nel tessuto o specificità
di distribuzione tissutale)
> è la permanenza nell’organismo,
> è la distribuzione, ma non sempre
(es. IL2-PEG)
PROTEINE RICOMBINANTI:
LEGAME A PROTEINE
Provato per IGF-I, t-PA, hGH, Dnasi
Per le molecole tradizionali solo il
farmaco libero svolge attività
farmacologica
Per proteine ricombinanti, il legame
a proteine plasmatiche può favorire
l’attività (es IGF-I)
PROTEINE RICOMBINANTI:
METABOLISMO-ELIMINAZIONE
Metabolismo non presenta rischio di
tossicità
Principali organi di eliminazione:
rene (via principale per proteine di
piccole dimensioni)
fegato (endopeptidasi, esopeptidasi)
altri
PROTEINE RICOMBINANTI:
VARIAZIONI FARMACOCINETICHE
-modificazioni della sequenza
aminoacidica
-pegilazione (ridotta vel. di
eliminazione)
-variazioni nella glicosilazione
(variano interazioni recettoriali o
attacchi enzimatici)
PROTEINE RICOMBINANTI:
IMMUNOGENICITA’
Produzione di anticorpi più frequente
per proteine estranee all’ospite
Dimostrata per varie prot. ricombinanti
(insulina, interferoni, ab monocl., EPO,
hGH ecc.).
PROTEINE RICOMBINANTI:
IMMUNOGENICITA’ - CAUSE
Fattori associati al prodotto: presenza di
impurezze/contaminanti, via di
somministrazione, conservazione, variazioni
di seq. aacidica/glicosilazione
Fattori genetici associati al paziente:
delezioni o mutazioni della proteina
endogena
aplotipo del complesso maggiore di
istocompatibilità (MHC)
PROTEINE RICOMBINANTI:
IMMUNOGENICITA’
Le conseguenze di una prod. anticorpale
sono diverse a seconda della regione
della proteina a cui si legano:
- nessun effetto (hGH)
- variazione di parametri farmacocinetici
(insulina)
- neutralizzazione (NAB) dell’attività
biologica (IFNa)
PROTEINE RICOMBINANTI:
IMMUNOGENICITA’
CASO ERITROPOIETINA (EPREX):
- fino al 1998 rari casi di prod. NAB
(conseguenza aplasia eritrocitaria)
-circa 200 casi dal 1998 al 2003
Dal 1998 HSA sostituita da polisorbato
80, venduta in siringhe pre-riempite
(rilascio di sostanze dalla siringa?).
Modifiche dei materiali della siringa e di
conservazione (riduzione dei casi di NAB)
PROTEINE RICOMBINANTI:
“INFUSIONAL REACTION”
Definibile come reazione “anafilattoide”,
mima una reazione anafilattica (IgE
mediata) ma non ha coinvolg. anticorpale
Manifest. frequenti: brividi, instabilità
emodinamica, dispnea
Si osserva durante la prima infusione o
poche ore dopo, rara alle infusioni
successive
Fattore importante: velocità di infusione
CITOCHINE - FATTORI DI
CRESCITA EMATOPOIETICI
Regolano ematopoiesi
(proliferazione, differenziazione,
maturazione) e attività funzionale di
cellule mature
sono glicoproteine con ponti
disolfuro tra gruppi cisteinici spesso
essenziali per l’attività biologica
CITOCHINE - FATTORI DI
CRESCITA EMATOPOIETICI
Colony-stimulating factors per
granulociti (G-CSF), granulocitimacrofagi (GM-CSF), macrofagi (MCSF), eritropioetina (EPO), IL-3, ecc.
G-CSF e GM-CSF sono prodotti in
forma sia glicosilata (CHO) sia non
glicosilata (E. coli), EPO in CHO
CITOCHINE - FATTORI DI
CRESCITA EMATOPOIETICI
Impieghi clinici:
G-CSF neutropenie, trapianto di midollo,
pazienti con HIV in terapia con
mielosoppressori
GM-CSF neutropenia, trapianto di midollo,
pazienti con HIV in terapia con antivirali
EPO anemia associata a insufficienza
renale cronica o chemioterapia
CITOCHINE - FATTORI DI
CRESCITA EMATOPOIETICI
Tossicità: G-CSF, GM-CSF perdita di
appetito, febbre, mal di testa
GM-CSF effetto indesiderato più grave è
la capillary-leak syndrome con elevati
dosaggi, reazione di prima dose
(tachicardia, ipotensione, vomito ecc), prod.
di anticorpi
EPO ipertensione/trombosi in soggetti
predisposti, aplasia eritrocitaria da NAB
CITOCHINE
INTERLEUCHINE-INTERFERONI
Sono glicoproteine che svolgono un
ruolo di comunicazione tra cellule dei
sistemi immunologico, ematologico,
neurologico.
Interleuchine deriva da inter-leucociti
interferone dall’abilità di interferire
con infezioni virali
CITOCHINE
INTERLEUCHINE (IL)
IL-1 mediatore della risposta a
infezioni, infiammazione
IL-2 prodotta da cellule TH1 stimola
crescita, differenziazione, attivazione
di cellule T, B, NK
IL-3 fattore di crescita ematopoietico
IL-4 …………..IL-17
CITOCHINE
INTERLEUCHINA -2
La proteina ricombinante è
disponibile commercialmente come
Proleukin, è prodotta in E. coli ed ha
due modificazioni aminoacidiche
rispetto alla proteina naturale
indicazione terapeutica: cancro
renale metastatico, melanoma
CITOCHINE
INTERLEUCHINA -2
Tossicologia:
la terapia approvata dalla FDA è ad alte
dosi; somm. i.v.: tox frequente, spesso
seria, a volte fatale; capillary-leak syndrome
che causa ipotensione con ridotta
perfusione degli organi; effetti cardiaci e
cardiovascolari quali aritmia, ischemia (s.c.
effetti meno gravi)
CITOCHINE
INTERFERONI (IFN)
Identificate tre classi a, b, g prodotte
da vari tipi cellulari (rispettivamente
leucociti, fibroblasti, T linfociti)
Gli effetti antivirali degli interferoni
sono causati da più meccanismi
vengono prodotte forme ricombinanti
di tutte e tre le classi
CITOCHINE IFN a
Identificati 14 sottotipi
prodotti singoli sottotipi ricombinanti in E.
coli: IFNa-2a (Roferon-A), IFNa-2b
(Intron A) anche pegilati; disponibili
miscele purificate da leucociti umani:
IFNa-n3 (Alfero-N), IFNa-ni (Wellferon).
Indicazioni terapeutiche: tumori (linfoma
non Hodgkin, ter. aggiuntiva cancro
rettale, etc.), epatite B e C, infezioni da
Papilloma virus
CITOCHINE
IFN a
Tossicità:
sindrome influenza-simile iniziale,
alterazioni della visione, diarrea,
vomito, affaticamento
anemia, cardiotossicità (aritmia
atriale) leucopenia, trombocitopenia
prod. di anticorpi neutralizzanti per i
non glicosilati
CITOCHINE
IFN b
Tre prodotti sul mercato:
IFN b-1b (Betaseron/Betaferon s.c.)
prodotto in E. coli con modificazione
aminoacidica
IFN b-1a (Avonex i.m. e Rebif s.c.)
prodotti nelle CHO
indicazioni terapeutiche:
sclerosi multipla recidivante-intermittente
CITOCHINE
IFN b
Tossicità:
-sindrome influenza-simile
-reazioni in sede di iniezione
-confusione, depressione, ansia
-anticorpi neutralizzanti con tutti i
composti (in particolare con
Betaseron)
CITOCHINE
IFN g
Presenti due forme con la stessa
sequenza aminoacidica, ma diversa
glicosilazione
Prodotto ricombinante: IFN g -1b
(Actimmune, i.m. e s.c.) in E. coli
indicazione terapeutica:
granulomatosi cronica
CITOCHINE
IFN g
Tossicità:
- sindrome influenza-simile
- leucopenia, ipotensione,
neurotossicità, trombocitopenia
- nessuna rilevazione di anticorpi
neutralizzanti
ANTICORPI MONOCLONALI
terapia con immunoglobuline nota
da due secoli
produzione anticorpi monoclonali
dal ‘75
1986: OKT3 approvato per
prevenire rigetto dopo trapianto
vari anticorpi oggi in uso per terapia
o diagnostica
ANTICORPI MONOCLONALI
Problema dell’uso di anticorpi
monoclonali murini: immunogenicità
sviluppo di anticorpi ricombinanti con
regioni variabili murine e costanti
umane - chimerici (-xi-)
sviluppo di anticorpi umanizzati (-zu-)
EVOLUTION OF ANTIBODY TECHNOLOGY
ANTICORPI MONOCLONALI
OKT3 Muromonab CD-3
Ab monoclonale murino specifico per
CD3 umano su cellule T è un potente
immunosoppressore
uso per prevenzione di rigetto dopo
trapianto di rene, cuore, fegato
unica terapia efficace in casi di
rigetto steroidi resistenti
ANTICORPI MONOCLONALI
OKT3 Muromonab CD-3
Effetti indesiderati:
immunogenicità (prod. di “versioni”
umanizzate, es HuOKT3 g1(AlaAla))
aumento incidenza infezioni
sindrome da rilascio di citochine
ANTICORPI MONOCLONALI
Abciximab (REOPRO)
Anti-integrine (molecole di adesione)
Antiglicoproteina IIb/IIIa Monoclonale chimerico per la
prevenzione della riocclusione
coronarica dopo angioplastica
Rituximab monoclonale chimerico che
lega l’antigene CD20 su linfociti normali
e maligni, Linfoma NH
ANTICORPO CHIMERICO (anti CD-20)
ANTICORPI MONOCLONALI
Trastuzumab (Herceptin,
Genentech)
anticorpo umanizzato anti HER2
(epidermal growth factor receptor 2)
approvato per cancro metastatico
alla mammella con
sovraespressione di HER2
ANTICORPI MONOCLONALI
Trastuzumab (Herceptin,
Genentech)
effetti indesiderati: flu-like
syndrome, nausea, vomito,
insonnia, suscettibilità ad infezioni;
in combinazione con chemioterapici
può dare cardiotossicità,
leucopenia, anemie
SINDROME DA CITOCHINE
CYTOKINE SYNDROME
Sindrome acuta a carattere
febbrile, che si verifica dopo
una o poche
somministrazioni di citochine
impiegate nella terapia di
varie patologie
CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E
MANIFESTAZIONI CLINICHE I
Le citochine agiscono da
“superantigene”
attivando una frazione elevata di cellule T
periferiche
Ondate successive di citochine sono prodotte,
con un ruolo centrale per TNFa
Sintomi lievi:
a carattere influenzale con leggera febbre nelle
prime 2-3 ore dalla somministrazione
Di media severità:
Lieve broncospasmo e/o ipotensione con
liberazione periferica di citochine (misurabili)
CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E
MANIFESTAZIONI CLINICHE II
Sintomi di elevata gravità
Grave febbre, broncospasmo, collasso
Manifestazioni biochimiche
aumento di creatinina, azotemia e
bilirubina, TNF, IL6 e recettori solubili IL2,
CD25,
LPB;
Aumento periferico di cellule NK e
linfocitosi
Nel caso di trattamenti anti-CD3
(muromonab) produzione di anticorpi
anti-murini
SINDROME DA CITOCHINE: ESPRESSIONE
DIPENDENTE DA T LINFOCITI
Espressione da parte di mononucleati
Tipo 1 (Th1):
aumento di IL-2, TNFa-b, IFN-g, immunità
cellulo-mediata ed effetti protettivi fagocitodipendenti
Tipo 2 (Th2):
aumento IL-4,-5,-10,-13: produzione di
anticorpi, attivazione di eosinofili, inibizione
di attività macrofagica (effetti fagocitoindipendenti)
Sindrome da citochine - I meccanismi
Meccanismo molecolare
Attivazione da parte di IFNg + TNFa della
iNOsintasi (iNOs)
Potenziamento
di
stress
ossidativi
endocellulari, inibizione del metabolismo
energetico, citotossicità.
In vitro a livello cardiaco iNOs aumenta
liberazione di CPK (creatinfosfochinasi)
Aggiunta di L-NMMA al medium di cultura
blocca iNOS e riduce la tossicità da TNFa
+IFNg
ESPERIENZA CLINICA DI
TOSSICITA’ DI CITOCHINA -I
OKT3 umanizzato (hOKT3g4)
(Richards et al, Cancer Res 59: 2096, 1999)
Umanizzazione di muromonab-CD3
impiegato nel rigetto di trapianto
(limiti per la formazione di anticorpi)
OKT3g4 è modificato per Igg4HC e Ig light
chain per sede antigenica simile ad OKT3
murino
ESPERIENZA CLINICA DI
TOSSICITA’ DI CITOCHINA -II
Fase I: infusione
i.v. 10 min ogni 2
settimane da 50 a 1600 g per iniezione, 6
per gruppo
Aumento progressivo di febbre, max 8001600 g
Aumento di recettori solubili IL2 (max 1600)
e concentrazioni di IL6 (max 1600)
CYTOKINE SYNDROME -FEVER AFTER hOKT3g4
CYTOKINE SYNDROME - Increased
soluble IL-2 R after hOKT3g4
CYTOKINE SYNDROME
Increased IL-6 after hOKT3g4
CYTOKINE SYNDROME - hOKT3
100 g - leggera febbre e cefalea in un
paziente; nessuna tossicità
200-400 g - febbre, cefalea, nausea e
rigidità
800 g - tutti febbre e nausea variabile; 3
rigidità ; 1 dispnea con richiesta di O2
1600 g (5 pazienti) - 2 gravi episodi di
dispnea, 1 con rigidità e grave cefalea
massima dose tollerata 800 g
CYTOKINE SYNDROME
POSSIBILITA’ DI TRATTAMENTO
Sintomatica:
Difenidramina e/o paracetamolo
Mannitolo, antiossidante
Pentoxifillina: teofillinico ad
azione
vasodilatatrice ed
antagonista delle citochine,
sopprime trascrizione di TNF
SINDROME DA CITOCHINE DA
PERFUSIONE CON rTNFa E
MELFALAN
Perfusione di arto con rhTNF-a
melfalan: trattamento di sarcomi
e
Nel 12-29% dei casi
sindrome da
citochine con ipotensione e aumento
circolante
di
IL-1,
IL-6
e
lipopolysaccharide binding protein (LPB)
Protocollo di trattamento contemporaneo
con pentossifillina 7.5 mg/kg/h
Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003
TRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINA
Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003
TRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINA
TRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINA
Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003