CLASSI DI RNA

NUCLEARI
hnRNA (heterogeneous nuclear RNA). Vi sono
compresi gli RNA messaggeri immaturi.
snRNA (small nuclear RNA). Basso peso
molecolare. Funzioni probabilmente catalitiche.

CITOPLASMATICI tRNA. Stabili, localizzati nel
citosol.Rappresentano il 10-20% dell’RNA totale.
rRNA. Stabili, localizzati nei ribosomi.
Rappresentano l’80-90% dell’RNA totale.
mRNA. Labili, localizzati nei poliribosomi.
Rappresentano il 2-5% dell’RNA totale.
scRNA. Unità 7 SL nella sintesi di proteine legate
a membrane e di proteine
secretorie
1
2
3
Le RNA polimerasi umane
Polimerasi
Localizzazione
Prodotto
RNA polimerasi I
nucleolo
18S, 28S, 5.8S rRNA
RNA polimerasi II
nucleo
hnRNA/mRNA,
U1, U2, U4, U5 snRNA
RNA polimerasi III
nucleo
tRNA, 5S RNA,
U6 snRNA, 7SL RNA(scRNA)
nella sintesi di proteine legate a
membrane e di proteine secretorie
mitocondriale
RNA polimerasi
mitocondrio
tutti gli RNA mitocondriali
_____________________________________________________________________________________________
Sensibilità delle RNA polimerasi nucleari alla a-amanitina1
RNA pol I
RNA pol II
RNA pol III
1
resistente
alta sensibilità (legata con K = 10-8 M)
bassa sensibilità (legata con K = 10-6 M)
ottapeptide ciclico dal fungo Amanita phalloides
4
minore
5
6
Struttura RNA polimerasi Procariotico
RNA polimerasi di E. coli è una proteina con multisubunità
Subunit
a
b
b’
s
a2bb’s
oloenzima
Number
2
1
1
1
Role
incerto
forma legami fosfodiesterici
lega il DNA stampo
riconosce il promoter e
facilita l’ inizio
a2bb’
core polimerasi
+
s
sigma factor
7
La funzione del fattore sigma
• la subunità sigma dell’RNA polimerasi è un “fattore inizio”
• ci sono alcuni differenti fattori sigma in E. coli che sono
specifici per differenti sets of geni
• il fattore sigma ha la funzione di assicurare che l’RNA polimerasi si leghi
stabilmente al DNA solo ai promoters
• sigma destabilizza legami nonspecifici al DNA non-promoter
• sigma stabilizza legami specifici al DNA promoter
• ciò accellera la ricerca per il DNA promoter
Ka (M-1)
Qualsiasi DNA
(nonspecifico)
Core
2 X 1011
Olo
1 X 107
DNA Promoter
(specifico)
1013 to 1015
8
• promoters variano in “forza” mediante ~due ordini di grandezza
Trascrizione
Complesso promoter chiuso (non srotolato)
RNA polimerasi
Complesso promoter aperto (separato a livello +1)
inizio
allungamento
terminazione
RNA prodotto
9
s
s
•Complesso promoter chiuso (moderatam. stabile)
• la subunità sigma si lega alla regione -10
RNA polimerasi oloenzima (+ s factor)
•complesso promoter aperto (altamente stabile)
•L’oloenzima ha molta alta affinità per
le regioni promoter a causa del fattore sigma
• una volta che si ha l’inizio, RNA polimerasi
non necessita di alta affinità per il promoter
• fattore sigma si dissocia dal core polimerasi
dopo poco allungamento
s
• sigma può ri-legare
altri core enzimi
• allungamento avviene con il
core RNA polimerasi
The sigma cycle
10
Struttura del Promoter in procarioti
5’
-30
[
-10
+1
Promoter
mRNA
PuPuPuPuPuPuPuPu
AUG
]
Sito inizio trascrizione
5’
-30 region
TTGACA
AACTGT
-10 region
TATAAT
ATATTA
-36
-12
-7
Pribnow box
-31
T T G AC A
TATA AT
82 84 79 64 53 45%
79 95 44 59 51 96%
sequenze consenso
+1
mRNA
+20
11
Classi di RNA procariotico
• RNA ribosomiale (rRNA)
16S (small ribosomal subunit)
23S (large ribosomal subunit)
5S (large ribosomal subunit)
• transfer RNA (tRNA)
• messenger RNA (mRNA)
Structure of prokaryotic messenger RNA
5’
Sequenza Shine-Dalgarno
PuPuPuPuPuPuPuPu
initiation
AUG
translated region
3’
AAU
termination
The Shine-Dalgarno (SD) sequence base-pairs with a pyrimidine-rich
sequence in 16S rRNA to facilitate the initiation of protein synthesis
12
13
14
Trascrizione e elementi del promoter dell’ RNA polimerasi II
+1
trascrizione
elementi
TE
P
Unità trascrizione
esoni
esoni
promoter
Promoter (Sequenze di DNA a monte di un gene)
• determina il sito di partenza (+1) per iniziare la trascrizione
• localizzato immediatamente a monte del sito di partenza
• consente un basso livello di trascrizione basale
Elementi Trascrizionali (sequenze di DNA che regolano il gene)
• determinano la frequenza o l’efficienza della trascrizione
• localizzati a monte, a valle, o entro i geni
• possono essere molto vicini o migliaia di coppie di basi da
un gene
• includono
enancers (incrementano la velocità di trascrizione)
silencers (diminuiscono la velocità di trascrizione)
elementi di risposta (sequenze target per il segnale di molecole)
• I geni possono avere numerosi elementi di trascrizione
15
Elementi Trascrizionali e promoter per RNA polimerasi II
trascrizionali
elementi
Unità trascrizione
TE
P
esone
esone
promoter
trascrizionali
elementi
TE
P
esone
esone
Complesso promoter
TE
P
esone
P
esone
esone
TE
TE
esone
16
La regione locus control è un elemento specializzato di transcrizione
region locus control
LCR
TE
gene A
P
gene B
TE
P
• una singola regione locus control (LCR) può controllare due o
più unità trascrizionali in maniera cellula-specifica
17
Sequenze di elementi entro un tipico gene eucariotico1
1
octamer
transcription
element
basato sul gene thymidine kinase
promoter
Elementi prossimali
+1
Promotore core o
elemento basale
ATTTGCAT
GC
CAAT
GC
TATA
-130
-95
-80
-50
-25
TATA box (TATAAAA)
• localizzato approssimat. 25-30 bp a monte del sito di partenza +1
• determina l’esatto punto di partenza (non in tutti i promoters)
• lega la proteina legante TATA (TBP) che è una subunità di TFIID
GC box (CCGCCC)
• lega Sp1 (Specificità per il fattore 1)
CAAT box (GGCCAATCT)
• lega CTF (fattore di trascrizione CAAT box)
Ottamero (ATTTGCAT)
18
• lega OTF ( fattore di trascrizione ottamero)
Elementi promotori prossimali




CCAAT-box (-80/-100 bp dal s.i.), lega CTF (CAAT box transcription
factor)
GC-box (GGGCGG, -40/-70 pb dal s.i.); lega Sp1 (Specificity factor1)
Ottamero (ATTTGCAT), sito di legame dei FT Oct-1 e Oct-2
Siti di legame di proteine che fungono da attivatori o da repressori della
trascrizione a sec. se incrementano o riducono la velocità di trascriz.
19
20
Fattori di Trascrizione (Proteine di regolazione della trascrizione
con le relative sequenze di riconoscimento in cis)
Fattori
CREB
CTF
NF1
AP1
Sp1
OTF
NF-kB
HSTF
MTF
USF
ATF
HNF4
GR
AR
ER
TR
C/EBP
E2F
p53
Myc
Nome completo o funzione
Cyclic AMP response element binding protein
CAAT box transcription factor (=NF1) (binds GGCCAATCT)
Nuclear factor-1 (=CTF)
Activator protein-1 (dimer of the Fos-Jun proteins)
Specificity factor-1 (binds CCGCCC)
Octamer transcription factor (binds ATTTGCAT)
Nuclear factor kB
Heat shock transcription factor
Metal transcription factor
Upstream factor
Activating transcription factor
Hepatocyte nuclear factor-4 (nuclear receptor superfamily)
Glucocorticoid receptor (nuclear receptor superfamily)
Androgen receptor (nuclear receptor superfamily)
Estrogen receptor (nuclear receptor superfamily)
Thyroid hormone receptor (nuclear receptor superfamily)
CAAT/enhancer binding protein
E2 factor (named for the adenovirus E2 gene)
p53 (tumor suppressor protein)
Product of the c-myc protooncogene (dimerizes with Max)
21
Proteine che regolano la sintesi di mRNA eucariotico
Fattori generali di trascrizione o GTF
• TFIID (una proteina di multisubunità) si lega al TATA box
per iniziare l’assemblaggio dell’apparato trascrizionale
• la proteina legante TATA (TBP) lega direttamente il TATA box
• Fattori associati a TBP (TAFs) si legano a TBP
• TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH1, TFIIJ si assemblano con TFIID
RNA polimerasi II lega la regione del promoter tramite TFII’s
I fattori trascrizionali legandosi agli altri, elementi promoter e
elementi trascrizionali, interagiscono con le proteine al promoter
e ulteriormente stabilizzano (o inibiscono) la formazione di un complesso di
preinizio funzionale
1TFIIH
è anche coinvolto nella fosforilazione dell’ RNA polimerasi II, del DNA repair
(Cockayne syndrome mutations),e regolazione del ciclo cellulare
22
Legame dei fattori generali di trascrizione (complesso di preinizio)
E
F
TAFs
TFIID
B
H
TBP
A
J
-25
+1
• TFIID (una proteina di multisubunità) si lega al TATA box
per iniziare l’assemblaggio dell’apparato di trascrizione
• la proteina legante TATA (TBP) lega direttamente il TATA box
• fattori associati a TBP(TAFs) si legano a TBP
• TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIJ si assemblano con TFIID
23
Legame dell’RNA polymerase II
E
B
F
TFIID
H
TBP
A
J
RNA pol II
• RNA polimerasi II (una proteina di multisubunità) si lega alla
regione del promoter mediante interazione con i TFII’s
• TFs mobilitano l’ istone acetilasi al promoter
24
Assemblaggio del complesso di inizio della
trascrizione





L'inizio trascrizione richiede
un'ordinata associazione tra
GTF e RNA pol II
Il contatto iniziale viene fatto da
TFIID (proteina che lega la
sequenza TATA, TBP, + 12
fattori associati alla TBP, TAF)
Si forma il complesso di preinizio tramite il legame di altri
GTF: TFIIA, TFIIB,
TFIIF/RNA pol II, TFIIE e
TFIIH
L'RNA pol II lascia il complesso
di preinizio e comincia a
sintetizzare RNA
La > parte dei GTF si stacca dal
Promotore, lasciando TFIID
25
legato al DNA
Legame di specializzati TFs
E
F
TFIID
B
H
TBP
A
J
+1
RNA pol II
• I fattori di trascrizione si legano agli
altri elementi del promoter e elements trascrizionali interagendo
con le proteine del promoter e ulteriormente stabilizzano (o inibiscono)
la formazione di un complesso di preinizio funzionale
• questo processo è chiamato “transattivazione”
26
Formazione di un complesso di preinizio stabile
E
B
F
TFIID
H
TBP
J
+1
RNA pol II
• la stabilità e la frequenza con cui si formano i complessi
determina la velocità di inizio della trascrizione
• la velocità di inizio della trascrizione è importante nel
determinare l’abbondanza di una specie di mRNA
27
Inizio della trascrizione e liberazione del promoter
E
B
F
TFIID
H
initiation
TBP
J
+1
RNA pol II
CTD
P
P
P
• RNA pol II è fosforilata da TFIIH sul dominio carbossi terminale
(CTD), liberandosi così dal complesso di preinizio e potendo
iniziare la sintesi di RNA muovendosi lungo il gene
28
29
Funzioni specifiche dei GTF







TFIID (componente TBP): riconoscimento
della sequenza TATA e prob. Inr
TFIID (TAF): riconosce il promotore core;
regola il legame di TBP
TFIIA: stabilizza il legame di TBP e TAF
TFIIB: intermediario nel reclutamento
dell'RNA pol II; influenza la selezione del
punto di inizio trascrizione
TFIIF: recluta l'RNA pol II
TFIIE: recluta TFIIH; modula le attività di
TFIIH
TFIIH: elicasi: transizione dal complesso
chiuso al complesso aperto; e chinasi
clearance del promotore da parte della
polimerasi
30
31
32
33