Università di Bologna
Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale
Sezione di Microbiologia
Tecniche di amplificazione real-time nella
determinazione della carica virale
Parvovirus B19 e Papillomavirus umani
Giorgio Gallinella
Real-Time PCR nella diagnosi virologica
Diagnosi virologica e determinazione del carico virale
La ricerca di acidi nucleici virali mediante PCR assicura:

Specificità – la scelta nell’utilizzo dei primer determina il bersaglio
della reazione

Sensibilità – la definizione delle condizioni di reazione determina il
livello di sensibilità della reazione
La determinazione quantitativa mediante real-time PCR permette:

Valutazione quantitativa come parametro diagnostico

Valutazione quantitativa in corso di screening

Valutazione quantitativa in corso di follow-up
Real-Time PCR nella diagnosi virologica
Diagnosi virologica e determinazione del carico virale
La determinazione mediante PCR end-point fornisce informazioni
qualitative:

Informazioni quantitative possono essere ottenute mediante
modificazioni della tecnica di base (diluizioni end-point, PCR
competitiva, …)
La determinazione mediante PCR real-time fornisce informazioni
quantitative:

Informazioni quantitative possono essere ottenute direttamente
mediante analisi in tempo reale delle curve di accumulo dei
prodotti di reazione
Real-Time PCR nella diagnosi virologica
Diagnosi virologica e determinazione del carico virale
La tecnica di PCR real-time:

Si basa sulla rivelazione dell’emissione luminosa di fluorocromi
presenti nella miscela di reazione



Utilizza strumenti che sono in grado di rilevare in tempo reale
l’emissione luminosa dei fluorocromi



Fluorocromi intercalanti (SybrGreen)
Flurocromi legati a sonde (FRET, Taqman, Molecular Beacons)
Thermal Cyclers a blocco
Thermal Cyclers ad aria
Utilizza software in grado di effettuare analisi quantitative e delle
curve di melting dei prodotti di amplificazione
Real-Time PCR nella diagnosi virologica
Diagnosi virologica e determinazione del carico virale
Determinazione quantitativa mediante PCR real-time nello studio
delle infezioni da Parvovirus B19 e Papillomavirus umani
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Caratteristiche molecolari di Parvovirus B19
• Famiglia Parvoviridae
• Genere Erythrovirus
• DNA monocatenario
 5600 nucleotidi
• Struttura icosaedrica
• Privo di pericapside
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Schema patogenetico dell’infezione da Parvovirus B19
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Principali manifestazioni cliniche dell’infezione da Parvovirus B19

Eritema infettivo

Artralgie/Artropatie

Crisi aplastica transitoria

Idrope fetale e infezioni congenite

Possibile sviluppo di infezioni persistenti

Valutazione del carico virale per una più corretta valutazione
del processo infettivo

Necessità di valutare l’andamento temporale del carico virale
nel corso di infezioni croniche o persistenti
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Vie di trasmissione dell’infezione da Parvovirus B19

Trasmissione aerogena

Trasmissione materno-fetale

Trasmissione mediante sangue ed emoderivati

Necessità di valutare il carico virale nelle unità di donazione e
nei pool di plasma per la produzione di emoderivati

Valore soglia ammesso di contaminazione da parvovirus B19
nei pool di plasma per la produzione di emoderivati pari a
104 UI/ml
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Infezione in soggetti normali

Picco viremico e graduale clearance virale

Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM
e IgG

Depressione transitoria della funzionalità
midollare – scomparsa dei reticolociti, calo
modesto dell’emoglobina

Manifestazioni cliniche bifasiche:
1. Sintomi aspecifici
2. Rash, artralgia (quinta malattia)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Infezione in soggetti con stress eritroide

Picco viremico e graduale clearance virale

Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM
e IgG

Depressione acuta ma transitoria della
funzionalità midollare – scomparsa dei
reticolociti, calo profondo dell’emoglobina

Manifestazioni cliniche legate allo stato di
anemia profonda (TAC)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Infezione in soggetti con deficit del
sistema immunitario

Picco viremico e ritardata o assente clearance
virale

Deficit (quantitativo e/o qualitativo) di
anticorpi specifici di classe IgM e IgG

Depressione persistente della funzionalità
midollare – scomparsa dei reticolociti, calo
profondo dell’emoglobina

Manifestazioni cliniche legate allo stato di
anemia profonda (PRCA)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Diagnosi di infezione da Parvovirus B19
Materiale biologico
Sangue periferico, plasma, siero
Metodi di indagine
Ricerca virus mediante PCR
Determinazione anticorpi specifici anti-B19 (IgG+IgM)
Rilevanza diagnostica
Infezioni acute:
malattia esantematica, artropatia
crisi aplastica midollare
Infezioni croniche:
artropatia, aplasia eritrocitaria
Infezioni in gravidanza: infezione materna
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Diagnosi di infezione da Parvovirus B19
Materiale biologico
Sangue midollare, sangue fetale, liquido amniotico, biopsie tissutali
Metodi di indagine
Ricerca virus mediante PCR
Ricerca virus mediante ibridazione in situ
Rilevanza diagnostica
Infezioni acute:
Infezioni croniche:
Infezioni persistenti:
Infezioni in gravidanza:
crisi aplastica midollare
aplasia eritrocitaria
presenza del virus nei tessuti
infezione fetale
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Diagnosi di infezione da Parvovirus B19
Presenza di marcatori
Numero di campioni
Percentuale
DNA neg/ IgM neg/ IgG neg
123
35.8
DNA pos/ IgM neg/ IgG neg
14
4.1
DNA pos/ IgM pos/ IgG neg
9
2.6
DNA pos/ IgM pos/ IgG pos
40
11.6
DNA pos/ IgM neg/ IgG pos
36
10.5
DNA neg/ IgM pos/ IgG pos
26
7.6
DNA neg/ IgM neg/ IgG pos
96
27.8
Campioni con marcatore unico
40
11.6
344
100
Totale campioni
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Diagnosi di infezione da Parvovirus B19
Presenza di marcatori
Numero di campioni
Percentuale
DNA neg/ IgM neg/ IgG neg
123
35.8
DNA pos/ IgM neg/ IgG neg
14
4.1
DNA pos/ IgM pos/ IgG neg
9
2.6
DNA pos/ IgM pos/ IgG pos
40
11.6
DNA pos/ IgM neg/ IgG pos
36
10.5
DNA neg/ IgM pos/ IgG pos
26
7.6
DNA neg/ IgM neg/ IgG pos
96
27.8
Campioni unicamente DNA pos
50
14.6
344
100
Totale campioni
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
La ricerca del DNA di Parvovirus B19 mediante PCR deve:

Permettere una valutazione quantitativa del carico virale

Includere l’utilizzo di un reagente di controllo analitico
Modalità di quantificazione mediante real-time PCR:

Quantificazione relativa (riferimento a campione calibratore)

Quantificazione assoluta (riferimento a curva standard)

Utilizzo di un controllo analitico interno

Eterologo

Omologo
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Metodi di indagine
Ricerca virus mediante PCR
Sono state descritte numerose coppie di primers che consentono un’efficiente amplificazione del
bersaglio virale (del genoma virale oppure dellle diverse classi di messaggeri)
HR1
HR2
HR3
HR4
HR5
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Metodi di indagine
Ricerca virus mediante PCR: PCR Real-Time

Monitoraggio in tempo reale,
ciclo per ciclo, della quantità
di prodotto di amplificazione

Rivelazione della fluorescenza
emessa da un fluorocromo
intercalante (SybrGreen)

Rivelazione della fluorescenza
emessa da fluorocromi legati a
sonde oligonucleotidiche
(FRET, Taqman, Beacons, …)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Sviluppo di una tecnica di PCR real-time calibrata:

Amplificazione in due reazioni parallele del bersaglio virale e di un
bersaglio di riferimento eterologo

Rivelazione dei prodotti di PCR mediante SybrGreen e definizione, per
ciascuna reazione, di un crossing point

Quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto
mediante applicazione della formula:
ratio 
Etarget
Eref
ΔC P ta rg et( calb sample)
ΔC P ref ( calb sample)

Etarget ed Ereference sono le efficienze, determinate sperimentalmente, delle due
diverse reazioni di amplificazione

Cp (calb-sample) sono le differenze fra i crossing point del campione calibratore
e dei campioni in esame
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Virus
Amplificazione parallela del bersaglio
virale e del bersaglio di riferimento
Virus
Valutazione dell’efficienza della
reazione: EVirus = 1.909
Valutazione della variabilità della
reazione: CpVirus = 0.21-1.71%
Ref
Riferimento
Valutazione dell’efficienza della
reazione: ERef = 1.658
Valutazione della variabilità della
reazione: CpRef = 0.45-2.41%
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
9
Analisi di regressione
8
Slope
Log Calculated geq
7
1.000  0.010
6
SD of Slope
5
0.006  0.002
4
3
Standard Error
2
0.1190.038
1
R2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.996  0.002
Log Expected geq
Curve di regressione ottenute per la quantità calcolata di bersaglio virale rispetto alla quantità attesa,
utilizzando come campione calibratore ciascun campione nell’intervallo 10 1-108 geq
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
1.0E+10
1.0E+09
Determinazione quantitativa del carico
virale in campioni di siero
1.0E+08
Virus geq/ml
CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG1.0E+07
N=3, Media: 1.1e9; Mediana: 1.4e9
1.0E+06
CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG+
N=24, Media: 4.3e6; Mediana: 8.7e4
1.0E+05
CAMPIONI PCR+, IgM-, IgG+
1.0E+04
N=11, Media: 3.7e5; Mediana: 3.2e4
1.0E+03
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
1.0E+07
Analisi quantitativa
mediante real-time
PCR calibrata:
1.0E+06
Virus IU/ml
1.0E+05
Nei pazienti seguiti il
carico virale è risultato
compreso fra 102 – 106
geq/ml per periodi estesi
di tempo
1.0E+04
1.0E+03
1.0E+02
1.0E+01
1.0E+00
Days
100
200
Patient 1
300
Patient 2
400
500
600
Patient 3
Analisi mediante real-time PCR calibrata su campioni di siero ottenuti da pazienti con documentata
infezione persistente da Parvovirus B19, utilizzando come calibratore lo standard internazionale
NIBSC 99/800 all concentrazione di 104 geq/ml
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
1.0E+11
Analisi quantitativa
mediante real-time
PCR calibrata:
1.0E+10
1.0E+09
Virus geq/ml
1.0E+08
1.0E+07
In quattro campioni il
carico virale è risultato
superiore al valore soglia
predefinito di 104 geq/ml
1.0E+06
1.0E+05
1.0E+04
1.0E+03
1.0E+02
1.0E+01
1.0E+00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Pools
Analisi mediante real-time PCR calibrata su 16 pool di plasma destinati alla produzione di
emoderivati, costituiti ciascuno da 960 singole donazioni, utilizzando come calibratore lo standard
internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 104 geq/ml
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Pool #
geq/ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
1.81 x 10
06
1.36 x 10
02
2.29 x 10
00
7.68 x 10
02
5.17 x 10
03
2.24 x 10
02
1.99 x 10
02
3.39 x 10
00
5.02 x 10
03
1.15 x 10
02
6.08 x 10
02
3.10 x 10
08
2.88 x 10
02
1.27 x 10
04
1.57 x 10
02
1.21 x 10
10
IgG (IU/ml)
ISH
PCR
RT-PCR
15.21
29.55
23.18
36.77
9.65
19.20
21.56
35.47
84.45
23.98
20.55
46.27
27.10
27.37
19.76
11.71
Pos
Pos
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos
Neg
Neg
Neg
Pos
Pos
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos
Neg
Neg
Neg
Pos
Pos
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos
Neg
Neg
Neg
I pool contaminati da Parvovirus B19 ad un valore superiore a 104 geq/ml sono risultati infettanti in
esperimenti di infezione in vitro di cellule KU812Ep6, come dimostrato mediante ibridazione in
situ, PCR e RT-PCR per la ricerca di acidi nucleici virali
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Sviluppo di una tecnica di PCR real-time competitiva:

Amplificazione in unica reazione del bersaglio virale e di un bersaglio
competitore

Rivelazione dei prodotti di PCR mediante coppie di sonde con emissione di
segnali FRET e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point

Quantificazione assoluta mediante curve di calibrazione esterne
Competitore
Coppie di sonde oligonucleotidiche
e emissione di distinti segnali FRET
IR
ITR
NS
ITR
VP
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Virus
Amplificazione del bersaglio virale e del
bersaglio competitore
Reazione di amplificazione
Efficienza della reazione: EVirus = EComp = 1.98
Errore standard: 0.06;
R2: 1.00;
Effetto competitivo
Comp
Amplificazione inibita in presenza di 1 Log in
eccesso del bersaglio competitore
Ad equimolarità, CpVirus-Comp = -0.68 – +0.90
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Conclusioni (1)
Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di
Parvovirus B19:

L’utilizzo di un bersaglio di riferimento come controllo analitico consente
un monitoraggio sia delle fasi pre-analitiche che analitiche

La quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto e la
normalizzazione rispetto ad un bersaglio di riferimento eterologo
consentono di minimizzare gli errori nella valutazione quantitativa

La quantificazione assoluta mediante real-time competitiva risente in
maniera sensibile degli effetti di interferenza reciproca, ma può consentire
uno screening rispetto ad un valore soglia prefissato
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Conclusioni (2)
Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di
Parvovirus B19:

La determinazione quantitativa del carico virale in campioni di sangue
periferico consente di caratterizzare con maggior precisione il processo
infettivo e di seguirne lo sviluppo nel tempo

In prospettiva, la valutazione quantitativa dell’espressione virale in
campioni tissutali può consentire di definire il ruolo patogenetico del virus
in numerose situazioni di rilevanza clinica

La diffusione del virus nella popolazione e la sua presenza nel sangue per
periodi di tempo anche prolungati portano ad un rischio di trasmissione
del sangue per via ematica: la valutazione quantitativa permette di
discriminare i campioni di plasma con carico virale contaminante
superiore al valore soglia di sicurezza
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Caratteristiche molecolari dei Papillomavirus
• Famiglia Papillomaviridae
• Genere Papillomavirus
> 100 distinti genotipi
• DNA bicatenario
 8000 nucleotidi
• Struttura icosaedrica
• Privo di pericapside
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Infezione da Papillomavirus
Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus
Inibizione trascrizione di E6/E7
LCR
Fattori cellulari
E6/E7
Particelle virali complete
E1/E2
E4 E5
L1
L2
Differenziamento cellulare
Replicazione DNA
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Infezione da Papillomavirus
Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus
Blocco inibizione di E6/E7
LCR
Integrazione
E6/E7
TRASFORMAZIONE
IMMORTALIZZAZIONE
E1/E2
E4 E5
L1
L2
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR:

Rivelazione del DNA di un ampio spettro di genotipi mediante reazioni di
amplificazione che utilizzano coppie di primer di consenso

Tipizzazione del genotipo virale mediante sonde oligonucleotidiche
specifiche per i diversi genotipi

Valutazione della persistenza dell’infezione da genotipi di HPV ad alto
rischio oncogeno

Determinazione della carica virale e dello stato fisico che assumono
rilevanza:

In caso di persistenza dell’infezione per valutare il rischio oncogeno

Nel follow up di pazienti conizzate per CIN di alto grado per
identificare i casi di infezione persistente dopo il trattamento
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:

Metodi quantitativi che utilizzano pool di primer in grado di definire la
carica virale di un ampio spettro di genotipi, in relazione al numero di
cellule presenti nel campione, e che consentono la successiva
genotipizzazione virale
PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA

Metodi quantitativi genotipo-specifici per la valutazione della carica virale
di HPV16 e HPV18
PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 e HPV18

Metodi quantitativi genotipo-specifici per la definizione dello stato fisico
di HPV16 e HPV18
PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16 e HPV18
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA
PCR Real Time di consenso: Amplificazione con pool di primer (MGP5Bio/MGP6)
e marcatura dell’amplificato con Biotina
MGP5 Bio
MGP6
Genoma HPV
E6
E7
E1
E4
E5
L2
E2
L1
150 bp
BIO
La quantificazione avviene mediante interpolazione su curve di calibrazione esterna, sia per il
bersaglio virale (HPV) sia per il bersaglio cellulare (GAPDH) utilizzato per la normalizzazione
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA
Genotipizzazione in ELISA: Cattura dell’amplificato su pozzetti streptavidinati e
tipizzazione mediante l’utilizzo di sonde specifiche
per HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58
ABTS
Ab anti-DIG
POD
POD
sonde HPV
sonda DIG
genotipo specifica
amplificato
BIO
streptavidina
Amplificati
06
A
B
C
11
16
18
31
33
35
45
52
58
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16
HPV16
CONO
pap-colpo margini
22,520.20
HSIL/ANTZ2
FM
CIN3+HPV
1,459.50
LSIL/NTZ
720.2
HSIL/ANTZ2
FM
CIN3+HPV
110.1
520.2
17.8
LSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
FM
FM
CIN3+HPV
CIN3
160.6
7.7
36.5
28.6
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
IM
IM
IA1
CIN3+HPV
26.4
15.9
6.8
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
IM
IM
IM
6.8
HSIL/ANTZ2
6.7
4.1
1.3
cono
1° Follow up
2° Follow up
HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo
3° Follow up
HPV16 pap-colpo
350.1
LSIL/NTZ
Neg
NEG/NTZ
NEG/NTZ
87.23
NEG/NTZ
Neg
NEG/NTZ
NEG/NTZ
HSIL/ANTZ2
103.12
2.6
NEG/NTZ
NEG/ANTZ1
Neg
1.8
NEG/NTZ
NEG/ANTZ1
10
4.5
HSIL/ANTZ2
LSIL/NTZ
Neg
1.8
NEG/ANTZ1
LSIL/NTZ
Neg
2.6
CIN3
CIN3+HPV
IA1
9.3
0.3
3.9
HSIL/NTZ
HSIL/NTZ
HSIL/ANTZ2
3.3
0.2
2
NEG/NTZ
HSIL/NTZ
HSIL/ANTZ2
IM
CIN3
0.2
HSIL/ANTZ2
0.2
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
IM
IM
IA1
CIN3+HPV
0.3
0.8
LSIL/NTZ
HSIL/NTZ
0.6
0.4
LSIL/NTZ
NEG/NTZ
HSIL/ANTZ2
IM
CIN3
0.4
LSIL/ANTZ2
1.6
HSIL/ANTZ2
4° Follow up
HPV16 pap-colpo
4.2
NEG/ANTZ1
NEG/ANTZ1
ASCUS/NTZ
Neg
NEG/ANTZ1
1.3
2.3
HSIL/NTZ
Ca./ANTZ2
3.4
HSIL/NTZ
0.3
1.2
LSIL/NTZ
NEG/NTZ
3.2
LSIL/NTZ
2° trattamento di conizzazione

Le pazienti che hanno un’alta carica virale iniziale e mostrano un decremento della carica
virale dopo il trattamento risolvono spontaneamente l’infezione
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16
HPV16
CONO
pap-colpo margini
22,520.20
HSIL/ANTZ2
FM
CIN3+HPV
1,459.50
LSIL/NTZ
720.2
HSIL/ANTZ2
FM
CIN3+HPV
110.1
520.2
17.8
LSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
FM
FM
CIN3+HPV
CIN3
160.6
7.7
36.5
28.6
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
IM
IM
IA1
CIN3+HPV
26.4
15.9
6.8
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
IM
IM
IM
6.8
HSIL/ANTZ2
6.7
4.1
1.3
cono
1° Follow up
2° Follow up
HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo
3° Follow up
HPV16 pap-colpo
350.1
LSIL/NTZ
Neg
NEG/NTZ
NEG/NTZ
87.23
NEG/NTZ
Neg
NEG/NTZ
NEG/NTZ
HSIL/ANTZ2
103.12
2.6
NEG/NTZ
NEG/ANTZ1
Neg
1.8
NEG/NTZ
NEG/ANTZ1
10
4.5
HSIL/ANTZ2
LSIL/NTZ
Neg
1.8
NEG/ANTZ1
LSIL/NTZ
Neg
2.6
CIN3
CIN3+HPV
IA1
9.3
0.3
3.9
HSIL/NTZ
HSIL/NTZ
HSIL/ANTZ2
3.3
0.2
2
NEG/NTZ
HSIL/NTZ
HSIL/ANTZ2
IM
CIN3
0.2
HSIL/ANTZ2
0.2
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
HSIL/ANTZ2
IM
IM
IA1
CIN3+HPV
0.3
0.8
LSIL/NTZ
HSIL/NTZ
0.6
0.4
LSIL/NTZ
NEG/NTZ
HSIL/ANTZ2
IM
CIN3
0.4
LSIL/ANTZ2
1.6
HSIL/ANTZ2
4° Follow up
HPV16 pap-colpo
4.2
NEG/ANTZ1
NEG/ANTZ1
ASCUS/NTZ
Neg
NEG/ANTZ1
1.3
2.3
HSIL/NTZ
Ca./ANTZ2
3.4
HSIL/NTZ
0.3
1.2
LSIL/NTZ
NEG/NTZ
3.2
LSIL/NTZ
2° trattamento di conizzazione

Le pazienti che hanno una bassa carica virale iniziale e mostrano una carica virale
costante dopo il trattamento non risolvono spontaneamente l’infezione e mostrano una
persistenza/recidiva della lesione
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16
CARICA VIRALE HPV 16
STATO FISICO HPV 16

La carica virale e lo stato fisico di HPV 16 sono importanti parametri per la
valutazione del rischio oncogeno in pazienti con infezione persistente

Nelle infezioni persistenti il DNA virale può integrarsi nel genoma umano,
con interruzione dei geni E2/E1e conservazione dei geni E6/E7
 DNA di HPV 16 episomiale:
 DNA di HPV 16 misto:
 DNA di HPV 16 integrato:
E2/E6 = 1
1< E2/E6 < 0
E2/E6 = 0
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
CARICA VIRALE: espressa come numero di copie di E6 per 100.000 copie di GAPDH
CURVA STANDARD E6
CURVA STANDARD GAPDH
Costruzione delle curve standard per E6 e per GAPDH
La quantificazione del bersaglio virale E6 per ciascun campione è stata ottenuta per
interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare della rispettiva curva
standard, normalizzata sul valore corrispondente per GAPDH
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
STATO FISICO: espressa come rapporto di numero di copie E2/E6
CURVA STANDARD E2
CURVA STANDARD E6
Costruzione delle curve standard per E2 e per E6
La determinazione del rapporto E2/E6 per ciascun campione è stata ottenuta per
interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare delle rispettiva curve
standard
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
E6 HPV 16 plasmid
1
10%
20%
0,9
40%
0,8
0,5
100%
100%
90%
80%
0,4
60%
0,3
40%
0,2
0,1
E2 gene copies
80%
0,6
E6 gene copies
60%
0,7
20%
0
Full length HPV 16 plasmid
Due cloni plasmidici sono stati utilizzati per valutare sperimentalmente i diversi valori
del rapporto E2/E6, nell’intervallo relativo a 102 - 106 copie di E6
La PCR real-time può distinguere lo stato misto dallo stato episomiale quando più del
20% del DNA virale è allo stato integrato
È possibile costruire una retta di regressione lineare per distinguere lo stato episomiale
dallo stato misto in funzione del numero di copie di E6
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
1.20
STATO EPISOMIALE
1.00
E2/E6
0.80
0.60
0.40
STATO MISTO
0.20
0.00
1.00E+01
1.00E+02
1.00E+03
1.00E+04
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
E6 copies
Risultati dell’analisi per carica virale e stato fisico in 68 campioni citologici positivi per
HPV 16 DNA – distribuzione dei valori quantitativi attorno alla retta di regressione dei
valori di cut-off
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Stato fisico e carica virale
Lesione e carica virale
1.00E+08
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+04
CIN1
CIN2/3
IA1
MEDIA
3,59E+04
2,60E+06
3,22E+03
MEDIANA
2,32E+04
3,81E+05
1,50E+03
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
EPISOMALE
29.4%
MISTO
54.4%
INTEGRATO
16.2%
EPISOMIALE
MISTO
INTEGRATO
MEDIA
1,90E+05
3,20E+06
2,40E+04
MEDIANA
4,23E+04
7,25E+05
6,45E+03
LSIL
22.0%
HSIL
69.2%
IA1
8.8%
LSIL
HSIL
IA1
MEDIA
3,59E+04
2,60E+06
3,22E+03
MEDIANA
2,32E+04
3,81E+05
1,50E+03
Una elevata carica virale aumenta la probabilità di integrazione di HPV 16 nel genoma umano e
rappresenta un fattore di rischio per la progressione a carcinoma invasivo
Le cellule con DNA virale integrato acquistano un vantaggio di crescita sulle
altre cellule
infettate,INTEGRATO
si ha
EPISOMALE
MISTO
una selezione dei cloni cellulari con DNA integrato, un abbassamento
carica virale
e una
MEDIA della
1,90E+05
3,20E+06
2,40E+04
progressione della lesione
MEDIANA
4,23E+04
7,25E+05
6,45E+03
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Lesione e stato fisico
20.0%
10.7%
72.3%
100.0%
80.0%
17.0%
EPISOMAL
CONCOMITANT
INTEGRATED
La percentuale di DNA virale totalmente episomiale diminuisce con il progredire della gravità della
lesione (LSIL - HSIL)
La percentuale di DNA allo stato misto aumenta con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL)
DNA virale totalmente integrato è presente solo in lesioni di alto grado (HSIL) e nei carcinomi invasivi
Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Conclusioni (3)
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:



L’andamento della clearance virale nel corso del follow up è indicativo
della risoluzione o persistenza dell’infezione e quindi della possibile
persistenza o recidiva della lesione

Il decremento della carica virale conduce a risoluzione dell’infezione

Il mantenimento della carica virale indica una persistenza dell’infezione
La carica virale e lo stato fisico del DNA di HPVassumono rilevanza:

Un’alta carica virale è associata allo stato episomiale di HPV16

Una bassa carica virale è associata allo stato integrato di HPV16
La quantificazione del DNA di HPV nello stato episomiale vs. integrato
può assumere rilevanza nella valutazione del rischio oncogeno
Università di Bologna
Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale
Sezione di Microbiologia
Monica Musiani
Marialuisa Zerbini
Giorgio Gallinella
Simona Venturoli
Giovanna Gentilomi
Simone Ambretti
Elisabetta Manaresi
Monica Cricca
Francesca Bonvicini
Stefania Delbarba
Claudia Filippone