FERMENTAZIONE
Dal punto di vista strettamente chimico, la fermentazione è un
processo ossidativo anaerobico svolto da numerosi organismi
a carico di carboidrati (o raramente di aminoacidi) per la
produzione di energia.
Il termine fermentazione andrebbe comunemente riferito alla
produzione di alcool e deriva dal latino fervere (ribollire), usato
per indicare l'aspetto del mosto durante la preparazione del vino.
Nel linguaggio comune, il termine fermentazione è stato
ampiamente usato per indicare una qualsiasi trasformazione
catalizzata da un microorganismo ed in genere viene usato in
relazione a tutti i processi che permettono la moltiplicazione in
grande quantità dei microorganismi e l’ottenimento dei loro
prodotti metabolici.
1
Gli elementi necessari per la realizzazione di un processo
biotecnologico sono:
• I ceppi (che devono essere geneticamente stabili per fornire in
modo costante ed uniforme il prodotto desiderato).
• I terreni di coltura (nutriente ottimale).
• I fermentatori (bioreattori).
2
Uno schema di processo fermentativo deve prevedere le
seguenti fasi:
1. Si parte da un ceppo conservato (liofilizzato o in azoto liquido)
e se ne effettua la riattivazione del metabolismo.
2. Fase vegetativa, durante la quale si ha aumento della
concentrazione delle cellule e verifica della funzionalità del
ceppo. Si prepara quindi l’inoculo, cioè una sospensione
densa di cellule.
3. Produzione.
4. Trattamento della massa che esce dal fermentatore per
recuperare il prodotto desiderato.
3
4
RECUPERO DEI PRODOTTI
Un brodo di fermentazione è una miscela acquosa complessa di
cellule, prodotti extracellulari solubili, prodotti intracellulari, substrato
non metabolizzato, e altri componenti non utilizzabili.
La sequenza di operazioni attraverso le quali si arriva dal materiale
contenuto nel bioreattore al prodotto finale puro, può essere suddivisa
in 4 fasi:
1. Rimozione del particolato (solidi sospesi).
2. Separazione primaria.
3. Purificazione.
4. Isolamento del prodotto finale.
5
Un’operazione preliminare che può rendersi necessaria per
recuperare un prodotto intracellulare è la disintegrazione del
materiale cellulare.
Ciò può realizzarsi:
• meccanicamente (taglio, macinazione, ecc.);
• per lisi della parete e della membrana cellulare sfruttando
l’azione di opportuni enzimi.
6
Esiste una correlazione inversa fra il prezzo di vendita di un prodotto
e la sua concentrazione nel brodo di coltura.
7
1. RIMOZIONE DEL PARTICOLATO
I solidi sospesi vengono separati dalla soluzione, usando le tecniche
classiche della filtrazione, centrifugazione e sedimentazione, secondo
le proprietà iniziali del brodo di fermentazione e della densità finale
desiderata del solido recuperato.
La miscela che esce dal reattore può avere proprietà che rendono
difficile la separazione solido/liquido: spesso è molto viscosa o
gelatinosa e il particolato è molto disperso.
Quando la miscela ha proprietà che rendono difficile la
separazione, si rendono necessari dei pretrattamenti. I più comuni
includono una stagionatura, che consente alle cellule di aggregarsi
durante l’ultima parte della fase stazionaria, il riscaldamento, la
variazione del pH e l’aggiunta di flocculanti (polielettroliti, cloruro
di calcio, ecc.)
8
9
FILTRAZIONE
La miscela solido/liquido viene separata facendo passare il fluido
attraverso una barriera porosa (tessuto di cotone o altre fibre, reti
metalliche, carta, metalli sinterizzati, prodotti porosi di carbone, ecc.)
che trattiene il solido:
10
vuoto
11
CENTRIFUGAZIONE
La sospensione si muove sotto l’azione della forza centrifuga.
12
SEDIMENTAZIONE
Le particelle sedimentano sotto l’azione della forza gravitazionale.
13
2. SEPARAZIONE PRIMARIA
Durante questa fase viene molto aumentata la concentrazione del
prodotto desiderato.
Fra le tecniche più usate: estrazione con solventi, adsorbimento,
precipitazione ed ultrafiltrazione.
Estrazione con solventi:
Sfrutta la diversa ripartizione di un soluto fra due fasi liquide
immiscibili (acqua/solvente organico): il composto apolare si ripartisce
preferenzialmente nel solvente organico (apolare).
L’uso di solventi organici non è invece adatto per il recupero di quelle
molecole che, come gli enzimi, e altre proteine, non abbiano affinità
per i solventi apolari o siano da questi danneggiati.
14
L’estrazione con solventi organici è largamente impiegata per la
separazione di molti antibiotici, in particolare per le penicilline,
che hanno struttura:
A pH intorno a 7 il gruppo carbossilico è dissociato e la penicillina
è solubile in acqua (in forma di sale). Acidificando a pH 2-3, il
gruppo COO- viene protonato a COOH e la molecola diventa
prevalentemente apolare, e quindi estraibile con un solvente
organico apolare (amilacetato o butilacetato).
amilacetato
Trattando con una soluzione acquosa neutra/alcalina il solvente
organico contenente la penicillina, questa viene riportata in fase
15
acquosa.
Attraverso più stadi di estrazione si realizza anche la
purificazione del prodotto.
L’estrazione viene condotta portando in intimo contatto i due
liquidi immiscibili e quindi separando le due fasi.
Separatore-estrattore
Padbielniak.
La rapida rotazione
spinge i due fluidi
leggero (solvente) e
pesante (brodo) a
muoversi, a contatto,
in controcorrente
l’uno all’altro.
16
Scambio ionico:
Le resine a scambio ionico sono polimeri reticolati che portano gruppi
ionizzabili acidi (-SO3-H+, -COO-H+) o basici (-NR3+OH-, -NH3+OH-),
rispettivamente resine cationiche e anioniche.
I controioni H+ o OH- possono essere scambiati con ioni dello stesso
segno presenti nella soluzione con cui vengono a contatto:
17
L’antibiotico streptomicina, nella cui struttura è contenuta un’ammina
ciclica (streptamina) ionizzabile, viene recuperata dal brodo di coltura
mediante una resina cationica carbossilica:
Resinan-(H+)n + strepromicinan+ -> Resinan- strepromicinan+ + nH+
Successivamente, la streptomicina viene recuperata mediante
eluizione con acqua acidula, invertendo lo stadio iniziale di
adsorbimento e rigenerando la resina.
18
Il processo viene realizzato in colonne a letto fisso.
19
Precipitazione:
Può essere ottenuta in diversi modi:
•Per aggiunta di un precipitante che reagisca col soluto formando un
prodotto insolubile, spesso un sale. Per esempio:
Solvente organico + streptomicina + H2SO4 streptomicina solfato.2H2O
Acido citrico (aq) + Ca(OH)2  citrato di calcio 
Il citrato di calcio (o dicitrato di
tricalcio tetratridrato) è il sale di
calcio dell'acido citrico.
C12H10Ca3O14 x 4 H2O
Glutammato ammonico (aq) + acido  acido glutammico 
•Per aggiunta alla soluzione acquosa di solventi organici miscibili
(metanolo, acetone) si riduce la polarità del mezzo, riducendo anche la
20
solubilità delle sostanze (polari) da recuperare.
•Aggiunta di Sali (salting out) – il meccanismo di azione si basa
sulla sottrazione da parte del sale, ad elevata concentrazione,
dell’acqua di solvatazione delle biomolecole (polari), che
diventano perciò meno solubili.
•Aggiustamento del pH al punto isoelettrico, al quale la proteina
presenta un minimo di solubilità.
•Addizione di polielettroliti che agiscono come flocculanti
(promuovono l’aggregazione e la sedimentazione di particelle
colloidali che altrimenti rimarrebbero stabilmente in
sospensione per molto tempo).
•Riscaldamento (caso tipico delle proteine): in questo modo la
proteina globulare si denatura, srotolandosi e presentando verso
l’esterno un maggior numero di residui idrofobi, diminuendo così
la sua solubilità.
21
ultrafiltrazione:
Passaggio del fluido sotto l’azione di pressioni piuttosto elevate,
attraverso una membrana, in genere finemente porosa, che ferma le
grosse molecole.
Applicata per la separazione di proteine (enzimi) e altre
macromolecole.
22
3. PURIFICAZIONE
In questa fase si cerca di concentrare ulteriormente il prodotto oltre
che rimuovere la maggior parte delle impurezze residue. Le tecniche
più usate a questo scopo sono soprattutto l’adsorbimento e vari tipi di
cromatografia.
Precipitazione frazionata
Proteine con diversi punti isoelettrici possono essere separate
variando il pH.
23
Cromatografia a setacci molecolari
Permette di separare molecole di diverse dimensioni. La colonna è
riempita con particelle di gel con pori di una dimensione caratteristica.
Le molecole di dimensioni maggiori non possono diffondere nel gel e
passano rapidamente attraverso la colonna, mentre le specie più
piccole penetrano nel gel e si muovono più lentamente.
24
Cromatografia di affinità
Nella cromatografia di affinità (peculiare delle biotecnologie) si
sfrutta la specificità naturale che molte macromolecole
biologiche presentano per certe sostanze che, fissate su un
supporto, legano molto rapidamente e molto selettivamente la
propria “controparte”.
25
ISOLAMENTO DEL PRODOTTO FINALE
Gli ultimi trattamenti servono ad ottenere il prodotto desiderato nella
forma più adatta alla sua commercializzazione.
Il prodotto, se commercializzato sotto forma di solido, può essere
cristallizzato da una soluzione, centrifugato per ridurne l’umidità ed
infine essiccato.
Cristallizzazione – si raggiunge la sovrasaturazione del soluto, con
conseguente sua precipitazione, raffreddando la soluzione (nel caso
che la solubilità diminuisca al diminuire della temperatura) o
evaporando il solvente, eventualmente operando sotto vuoto per
abbassare la temperatura di ebollizione dello stesso.
26
Cristallizzazione evaporativa a circolazione forzata
27
Essiccamento
Generalmente viene realizzato facendo passare aria calda
attraverso il prodotto umido.
Liofilizzazione – è un metodo di essiccamento in cui il campione
viene prima congelato e poi sottoposto ad una forte
depressione che, per successivo blando riscaldamento, provoca
la sublimazione dell’acqua.
La liofilizzazione è molto utile per essiccare tutte quelle sostanze
che non sono danneggiate dal congelamento, come per molti
microorganismi, vaccini, proteine, ecc. inoltre la struttura
porosa lasciata dalla sublimazione facilita la reidratazione.
28