Basi della citofluorimetria a flusso
 Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso
una camero di flusso
 Riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza
 La luce emessa viene raccolta, filtrata e convertita ad un
valore digitale che viene inviato al computer
 Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal
passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila.
 Nel caso del campione riportato in figura, viene analizzata una
sospensione di globuli bianchi contente linfociti, monociti e granulociti
granulocito
linfocito
monocito
Scatter Frontale
(Forward Angle Light Scatter, FALS)
granulocito
Laser
Sensore per il
FALS
linfocito
monocito
Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà origine ad un
segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello scatter
frontale (forward), e che dà informazioni sul volume cellulare.
 Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantita’ di
luce “scatterata” nella direzione frontale (lungo lo stesso asse
attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale
del Forward Scatter
 L’intensita’ del Forward Scatter e’ proporzionale alla
dimensione, forma, ed omogeneita’ ottica delle cellule (o delle
altre particelle analizzate)
Scatter Laterale
(90 Degree Light Scatter)
granulocito
Laser
linfocito
Sensore FALS
monocito
Sensore per il 90O LS
Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che viene
captato dal sensore che raccoglie la luce dello Scatter Laterale, a 90 gradi e
che dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il rapporto
nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser
 Quando si utilizza una sorgente laser, la quantita’ di luce
“scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse attraverso
cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del Side
Scatter
 Anche l’intensita’ del side scatter e’ proporzionale alla
dimensione, forma ed omogeneita’ ottica delle cellule (o delle
altre particelle analizzate)
Proprietà tipiche del Forward e del Side Scatter
 Il Forward Scatter tende ad essere piu’ sensibile alle
proprieta’ della superficie cellulare delle particelle e pertanto
puo’ essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte
 Il Side Scatter tende ad essere piu’ sensibile alle inclusioni
presenti all’interno della cellula e pertanto puo’ essere usato
per distinguere cellule granulate da quelle non-granulate.
Sistema ottico del citofluorimentro
I filtri dicroici, i “bandpass” filtri permettono il
passaggio della luce solo ad una certa lunghezza
d’onda.
cella di flusso
filtri dicroici
Fotomoltiplicatori
(PTMT)
filtri bandpass
I fotomoltiplicatori, che raccolgono ed amplificano il segnale luminoso
filtrato e ricevuto. In questo specifico caso, il PMT1 funziona come scatter
a 90 gradi, e raccoglie la luce rifratta/diffratta (“scatterata”) dalle cellule.
Filtri ottici: rilevamento dei parametri fisici
Filtro dicroico/specchio a 45 gradi
Sorgente luminosa
Luce trasmessa
Forward Scatter
Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico
Leucociti del sangue periferico
90 Degree Scatter
si possono facilmente
identificare tre popolazioni:
- linfociti,
- monociti
- granulociti.
Si puo’ disegnare un “gate”
elettronico che permetterà
in seguito l’analisi del
segnale di fluorescenza
proveniente soltanto dalla
popolazione scelta
Forward Scatter
90 Degree scatter
Nuclei di linfociti normali o apoptotici
Forward scatter
Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule
trattate con una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare
immediatamente cellule normali da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti
condensati e raggrinziti, ovvero diminuiscono il FSC ed aumentano il SSC.
Esempi di filtri ottici
Standard Long Pass Filters
520 nm Long Pass Filter
Sorgente luminosa
Luce trasmessa
I filtri ottici hanno il compito di pemettere il passaggio della
luce emessa dai fluorocromi eventualmente legati alle cellule
soltanto ad una certa lunghezza d’onda.
Il filtro raccoglie la luce verde (tipicamente designata FL1),
Standard Short Pass Filters
575 nm Short pass Filter
Sorgente luminosa
Luce trasmessa
< 575 nm
Il filtro raccoglie la luce arancione (FL2).
Standard Band Pass Filters
630 nm Band Pass Filter
Sorgente luminosa
Luce trasmessa
620-640 nm
Un terzo filtro può raccogliere la luce emessa ad una lunghezza d’onda
ancora maggiore (in questo caso, nella regione del rosso profondo).
Raccolta della fluorescenza da una popolazione
Laser
Fluorescence detectors
In questo esempio, riferito ad un paziente con infezione da HIV, sono stati
identificati i linfociti in base al Forward e Side scatter, e su queste cellule è stata
fatta l’analisi delle sottopopolazioni con anticorpi anti-CD3 (in FL1), anti-CD4 (in
FL2) ed anti-CD8 (in FL3).
Il “Sorting cellulare”
FALS sensor
FACS:
Fluorescence
Activated
Cell
Sorting
Cellule singole separate
dentro diverse provette
Fluorescence detector
Piastre cariche
elettricamente