Corso teorico-pratico finalizzato allo sviluppo
continuo professionale
Trichine nelle carni e controllo ufficiale
Regolamento (CE) n. 2075/2005
Ravenna 12 Dicembre 2007
[email protected]
Regolamento (CE) N.
2075/2005 Allegato 1
METODI DI
RILEVAMENTO
Altri documenti rilevanti

Commissione Internazionale sulla Trichinellosi
(2000)


Raccomandazioni sui metodi per il controllo di
Trichinella negli animali domestici e selvatici destinati
al consumo umano
European Commision (2001)

Opinion Of the Scientific Committee on Veterinary
Measures relating to Pubblic Health on Trichinellosis,
epidemiology, methods of dectection an Trichinellafree pig production
Altri documenti rilevanti

Laboratorio Comunitario di Referenza per i
Parassiti, ISS (2006)

Guideline for the detection of Trichinella
larvae at the slaughterhouse or connected
laboratory in a Quality Assurance System
Campioni

Suino





1 grammo dal pilastro del diaframma
2 grammi per scrofe o verri
2 grammi altri punti diaframma o mascella,
lingua, muscoli addominali (4 g per scrofe o
verri)
Altri muscoli 5 grammi
Equino

10 grammi di lingua o massetere
Siti di predilezione
Suini domestici
Cavalli
Cinghiali
Volpe
Diaframma, lingua,
massetere
Lingua,
massetere,
diaframma
Lingua,
diaframma,
muscoli arto
anteriore
Lingua, muscoli arto
anteriore
Metodi di rilevamento

Metodo di riferimento


Metodo dell’agitatore magnetico con
digestione artificiale di campioni aggregati
Metodi equivalenti



Digestione artificiale e sedimentazione
(Stomacher)
Digestione artificiale e filtraggio
Digestione automatica fino a 35 g
(Trichomatic)
Metodi di rilevamento

Tutti i metodi di rilevamento (ad eccezione
dell’esame trichinoscopico), si basano sullo
stesso principio



Digestione cloro-peptica del muscolo
Evidenziazione delle trichine liberate dalla
digestione
Variano le tecniche di digestione e di
rilevazione
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico (allegato 1, capitolo 1)




100 grammi (100
campioni di suino o
20 di equino)
Digestione cloropeptica tramite
agitatore magnetico
Sedimentazione del
digerito
Osservazione di un
sedimento liquido





Tempi di esecuzione
1,5/ 2 ore
Difficoltà tecnica di
esecuzione: bassa
Costo attrezzature:
basso
Costo manutenzioni:
basso
Impegno di
personale: alto
Metodo equivalente con filtrazione
(allegato 1, capitolo 2, B)




100 grammi (100
campioni di suino o 20
di equino)
Digestione cloro-peptica
tramite stomacher
Filtrazione e
Sedimentazione
accelerata da vibrazioni
Osservazione di un
sedimento liquido





Tempi di esecuzione 1
ora circa
Difficoltà tecnica di
esecuzione: alta
Costo attrezzature:
intermedio
Costo manutenzioni:
intermedio
Impegno di personale:
alto
Metodo equivalente con digestione
automatica (allegato 1, capitolo 2,
C)




Tempi di esecuzione 15-20
minuti per 35 campioni

Difficoltà tecnica di
esecuzione: bassa
35 grammi massimo
Digestione e
filtrazione automatica
Osservazione di un
filtro

Costo attrezzature: non
disponibili nuove
attrezzature

Costo manutenzioni: elevato

Impegno di personale:
basso
Esame trichinoscopico
(non rientra fra i metodi equivalenti)
Metodi di rilevamento

Esame trichinoscopico

Possibile utilizzo transitorio fino al 31/12/2009
per suino o cinghiali
Meno di 15 suini al giorno
 Esclusione bollo CEE
 Trattamento inattivamente le Trichine

Metodi di rilevamento

Esame trichinoscopico: limiti




Permette di osservare solo le Trichine incistate
 Non Trichinella pseudospiralis
E’ meno sensibile dei metodi con digestione anche per le
forme incistate
Per ogni animale vanno eseguite almeno 56 osservazioni
microscopiche (almeno 6 minuti per osservare un un
preparato)
Limite massimo 840 osservazioni al giorno pari a 15 suini
per operatore
Metodi di rilevamento
SENSIBILITA’
Metodo
Larve
EFFICIENZA
Numero suini testati in 2
ore
Metodo di
riferimento ed
equivalenti
3/100 g
Almeno 100
Esame
trichinoscopico
1/g
2 circa
Metodi innovativi

Sono metodi non ufficiali:




Già sviluppati in corso di validazione
In corso di sviluppo
Indiretti: ricerca anticorpi da siero (metodi
sierologici)
Diretti: ricerca Trichinella nel muscolo (PCR)
Metodo di riferimento
PRINCIPI, STRUMENTI,
REAGENTI E PROCEDURA
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico

Principio
 Comune a tutti i metodi ad eccezione del
trichinoscopico
 Utilizzo di “un succo gastrico artificiale” (a
base di acido cloridrico e tripsina) per digerire
il tessuto muscolare
 Tempo e temperatura sotto controllo
 Le cisti muscolari si rompono e le trichine
vengono rilasciate
 Concentrazione delle larve per
sedimemtazione e loro osservazione
microsopica
Trichinella incistata nel muscolo
Trichinella nel liquido di
digestione
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico

Strumentazione molto semplice







Bilancia (digit 0,1)
Sminuzzatore tipo Moulinex o Minipimer
Termometro a mercurio o a sonda
Agitatore termoriscaldato
Imbuti, cilindri, supporti, pipette, piastre Petri
Steromicroscopio
Costo del laboratorio: 2000 € circa
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico


Reagenti
Pepsina 1: 10.000 NF corrispondente a 1:12 500
BP





Pepsina : 1 Kg costa 500 €, ogni pool da 100 g sono 5 €
Conservare in luogo fresco asciutto
Mantenere etichetattura
Possibile utilizzare formula liquida 660 EP unità/ml
Acido Cloridrico 25%

A partire dal comunemente reperibile 37% applicare
la proporzione


37:100=25:X
Aggiungere lentamente 67,5 ml di HCl 37% a 32,43 ml di acqua
distillata
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico

FASE 1: preparazione aggregato





Suino 100 campioni da 1 g
Equino 20 campioni da 5 g
E’ possibile aggiungere 15 grammi ad una
serie completa (15 suini e 3 equini)
Se l’aggregato inferiore o uguale a 50 grammi
si utilizzerà metà del liquido di digestione
Utilizzo della bilancia
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico

FASE 2: sminuzzamento
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico

FASE 3: Preparazione liquido di
digestione





Preparare 2 litri di acqua preriscaldata a 4648°C
Aggiungere 16 ml di HCl 25%
Introdurre barra di agitazione
Aggiungere 10 g di pepsina
Se aggregato ≤ 50 grammi dimezzare tutto
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico

FASE 4: digestione

Trasferire nel becher la carne sminuzzata

L’agitatore magnetico deve mantenere il
agitazione a temperatura controllata

Controllare con termometro 44-46°C

Tempo di digestione 30 minuti salvo eccezioni
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico





FASE 5. sedimentazione
Trasferimento tramite setaccio in imbuto
separatore per sedimentazione (30 minuti)
Raccolta di 40 ml di liquido
Sedimentazione per 10 minuti
10 ml di sedimento + 10 ml di acqua
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico

FASE 6 : Osservazione microscopica


Stereomicroscopio 15/20 ingrandimenti
Sospetti 60-100 ingrandimenti (microscopio
ottico)
Metodo di riferimento
PUNTI DI CONTROLLO CRITICO
(CCP)
E REQUISITI
Digestione in pool: punti di
controllo critico

CCP 1: Identificazione dei campioni


Numero dei campioni uguale al numero dei
suini analizzati
Possibilità di risalire ai suini di provenienza
Metodo di riferimento: agitatore
magnetico

CCP1


Garantire la tracciabilità fra campione e carcassa o
partita di carcasse
Predisporre un foglio di lavoro in cui siano riportate le
informazioni necessarie







Data
Identificazione partite/animali
Operatore ha eseguito la prova (firma)
Operatore ha eseguito la prova (firma)
Operatore che legge l’analisi (firma)
Registrazione lotti reagenti
Risultati
INTESTAZIONE LABORATORIO / MACELLO
RICERCA LARVE TRICHINELLA SPP TRAMITE METODO DELL’AGITATORE MAGNETICO
METODI DI RIFERIMENTO REGOLAMENTO (CE) 2075/2005
DATA ANALISI................................................
NUMERO CAMPIONI…………………………..
SPECIE.................
NUMERO POOL………………
POOL 1 da………. a………… CORRISPONDENTI A:
partita/e
Lotto pepsina:
Animale/1
Lotto HCl:
POOL 2 da………. a………… CORRISPONDENTI A:
partita/e
Animale/1
POOL 3 da………. a………… CORRISPONDENTI A:
partita/e
Animale/1
PRELIEVO……………………………….
DIGESTIONE…………………………….
RISULTATO:
• NON DIMOSTRATA LA PRESENZA DI TRICHINELLA
 DIMOSTRATA LA PRESENZA DI TRICHINELLA sul/sui pool ……..
LETTURA…………………………………
DATA FINE
Digestione in pool: punti di
controllo critico

CCP 2: Qualità del liquido digestivo


Giusto rapporto tra liquido digestivo e
quantità di tessuto
Misurazioni di pepsina e acido cloridrico
ATTENZIONE:
Non miscelare mai direttamente pepsina e
acido cloridrico!

Digestione in pool: punti di
controllo critico

CCP 3: Temperatura di digestione (4446°C)



Se superiore: inattivazione della pepsina,
incompleta digestione
Se inferiore: tempi di digestione più lunghi,
incompleta digestione
Requisito: taratura del termometro
Digestione in pool: punti di
controllo critico

CCP 4: Efficacia della digestione
 Controllare
setaccio
 Se
 Se
il materiale che rimane nel
connettivo: campioni non ottimali
muscolo indigerito: digestione
inefficace
Digestione in pool: punti di
controllo critico

CCP 5: Tempo di sedimentazione

Almeno 30 minuti

Utlizzare contaminuti con allarme sonoro
Digestione in pool: punti di
controllo critico

CCP 6: Sufficiente chiarificazione


Possibile lettura di piccoli caratteri a stampa
attraverso la Piastra Petri contenente il liquido
Ripetere l’ultimo passaggio di sedimentazione
aggiungendo acqua di rubinetto
Digestione in pool: punti di
controllo critico

CCP 7: Stereomicroscopio

Ingrandimenti sufficienti (15- 20 meglio fino a
40)

Pulizia

Manutenzione annuale da ditta esterna
Metodo di riferimento
REQUISITI STRUTTURALI
Requisiti strutturali


Sorgenti di energia elettrica
Lavabo con collegamento rete idrica





Approvvigionamento acqua
Lavaggio vetreria
Illuminazione idonea
Spazio sufficiente
Lavastoviglie (utile ma non necessario)
Metodo di riferimento
REQUISITI DI PERSONALE
Regolamento (CE) n. 2075/2005



Tutto il personale che partecipa all’esame
dei campioni deve essere adeguatamente
formato
Programma di controllo delle qualità delle
analisi
Analisi regolare delle procedure di
valutazione, registrazione ed analisi
Sicurezza in laboratorio
Pericolo Biologico
(Trichinella)
Rischio quasi trascurabile
Dose infettante 100/300 larve vitali
Malattia mai dimostrata in seguito a infestazioni in
laboratorio
Misure precauzionali di base








Camice
Guanti
Non mangiare, bere, fumare durante esecuzione analisi
Non pipettare con la bocca
Sicurezza in laboratorio
Pericolo Chimico


(Acido cloridrico da 37 a 25%)
Scheda di sicurezza (è obbligatoria)
Misure precauzionali


Mantenere il luogo areato le bottiglie o in
armadio aspirato
In assenza di cappa chimica, utilizzare DPI per
proteggere cute, vie respiratorie e occhi
Sicurezza in laboratorio
Il Ring Test




Prova interlaboratorio con cadenza
annuale
Nel 2007 hanno partecipato
complessivamente 31 laboratori
I° ciclo Febbraio
II ciclo Maggio


Esito non conforme al primo ciclo (audit)
Nuove designazioni
Il Ring Test

Preparazione campioni negativi


Polpetta da 100g o 35 g di carne suina magra
macinata
Preparazione campioni positivi


Polpetta come sopra
Frammenti di muscolo di topo infestato fornito
da ISS
Il Ring Test




Caratteristiche campioni positivi
Contengono larve vive (come nella realtà)
Contengono un numero di larve pittosto
realistico (II ciclo media=35, ds=22)
Controllati qualitativamente uno ad uno
(impossibile che siano negativi)
Numero esatto delle larve non conosciuto a
priori (stimato)
Il Ring test


Precauzioni
Larve infestanti (rischio molto basso)
Dopo avere analizzato un campione positivo:




Lavare accuratamente tutte le attrezzature e la
vetreria con detergente, spugnetta e scovolino
Attenzione le larve tendono ad aderire alla veteria
Rischio di contaminazioni crociate
Testare un campione negativo per prova
Il Ring Test
Precauzioni Trichomatic
praticare il programma di lavaggio diverse volte
(almeno 4o 5) aggiungendo, nella camera di
digestione, alcuni cc di detersivo per piatti diluito
in acqua, pulire attentamente il portafiltro e la
reticella di protezione con detergente e spazzola.
Al termine di tali lavaggi effettuare una
digestione a vuoto (con solo acqua) valutando
se nel filtro vi sono ancora larve"