LA RICERCA DELLE SOSTANZE
INIBENTI NEL LATTE OVINO
GLI ANTIBIOTICI SONO COMPOSTI
CAPACI DI UCCIDERE O INIBIRE LA
CRESCITA DI AGENTI PATOGENI
SONO PRODOTTI DA BATTERI E
FUNGHI PER LIMITARE O IMPEDIRE LA
CRESCITA DI ALTRI MICRORGANISMI
LA CLASSIFICAZIONE SI BASA
PRINCIPALMENTE SUL
MECCANISMO D’AZIONE
CONTRO L’AGENTE PATOGENO
• ALCUNI ANTIBIOTICI ATTACCANO LA
PARETE CELLULARE BATTERICA,
• ALTRI ROMPONO LA MEMBRANA CELLULARE
• LA MAGGIOR PARTE DI ESSI INIBISCE LA
SINTESI DEGLI ACIDI NUCLEICI E DELLE
PROTEINE, MOLECOLE ESSENZIALI PER LA
VITA DEGLI ORGANISMI.
GLI ANTIBIOTICI POSSONO ESSERE
ANCHE CLASSIFICATI IN BASE ALLA
STRUTTURA CHIMICA
•
•
•
•
•
•
•
SI POSSONO ALLORA DISTINGUERE:
RIFAMICINE
CLORAMFENICOLO
AMMINOGLICOSIDI
TETRACICLINE
MACROLIDI
BETA-LATTAMICI
SULFAMIDICI
TETRACICLINE
ANTIBIOTICI BATTERIOSTATICI CHE
INIBISCONO LA SINTESI PROTEICA
DELLE CELLULE BATTERICHE
BETA LATTAMICI
AZIONE BATTERICIDA, DOVUTA ALLA
CAPACITA’ DI INIBIRE LA FORMAZIONE
DELLA PARETE CELLULARE BATTERICA
L’IMPIEGO DI FARMACI AD ATTIVITA’
ANTIMICROBICA SU LARGA SCALA HA
DETERMINATO E DETERMINA LA
PRESENZA DI RESIDUI DI FARMACI
NEGLI ALIMENTI.
DIVERSE SONO LE CAUSE DELLA PRESENZA
DEI RESIDUI NEGLI ALIMENTI E TRA LE
PIU’ FREQUENTI SI POSSONO CITARE:
• MANCATO RISPETTO DEI TEMPI DI
SOSPENSIONE PREVISTI PER IL FARMACO
• MANCATA O ERRONEA INDIVIDUAZIONE
DEGLI ANIMALI TRATTATI
• USI IMPROPRI DEL FARMACO ( ES.DOSAGGI
TROPPO ELEVATI )
GLI ANTIBIOTICI RAPPRESENTANO
• RISCHIO PER LA SALUTE PUBBLICA
• PROBLEMA TECNOLOGICO: INIBISCONO LE COLTURE
DI STARTER IMPIEGATI NELLA PRODUZIONE DI LATTI
FERMENTATI
• PRESSIONE SELETTIVA IN GRADO DI SELEZIONARE
CEPPI DI BATTERI ANTIBIOTICO - RESISTENTI NON
PATOGENI PER GLI ANIMALI, MA POTENZIALI AGENTI
TOSSINFETTIVI PER L’UOMO. ( DEPAUPERAMENTO
DELLA FLORA MICROBICA INTESTINALE CHE
FAVORISCE L’EVENTUALE ADESIONE DI BATTERI
PATOGENI )
LA CONSAPEVOLEZZA DEI POTENZIALI
RISCHI PER LA SALUTE DEL
CONSUMATORE HA INDOTTO I GOVERNI
DEI VARI PAESI A INTRODURRE NELLE
PROPRIE LEGISLAZIONI
CONCENTRAZIONI MASSIME DI RESIDUI
( Reg. 2377/90/CE )
( LMR= LIMITI MASSIMI DI RESIDUI )
TOLLERATE NEGLI ALIMENTI
IL TERMINE LMR SI PUO’ DEFINIRE COME
LA
MASSIMA CONCENTRAZIONE DEL
RESIDUO
INDICE DERIVANTE DALL’USO DI
MEDICINALI VETERINARI, ESPRESSO IN
ppm (mg/Kg) O ppb (μg/kg)
LEGALMENTE TOLLERATO.
IN PARTICOLARE LE TOLLERANZE
AMMESSE PER LE SOSTANZE PIÙ
LARGAMENTE IMPIEGATE IN MEDICINA
VETERINARIA PER IL TRATTAMENTO
DEGLI OVINI SONO :
TETRACICLINE 100 ppb (μg/kg)
PENICILLINA G 4 ppb (μg/kg)
OCCORRE SAPERE CHE I LIMITI MASSIMI
RESIDUI SONO STABILITI E FISSATI PER
ALIMENTI NON TRATTATI.
SAREBBE PERCIO’ IMPORTANTE AVERE
INFORMAZIONI SULL’INFLUENZA DI ALCUNI
TRATTAMENTI
( ES. CALORE ) CHE SUBISCE L’ALIMENTO
PRIMA DI ESSERE CONSUMATO E CHE
POSSONO DETERMINARE UN CAMBIAMENTO
NELLA STRUTTURA DELLE MOLECOLE AD
ATTIVITA’ FARMACOLOGICA
QUESTI TRATTAMENTI POSSONO RIDURRE,
LASCIARE INVARIATA O PEGGIORARE LA
PERICOLOSITA’ DELLE MOLECOLE
( ATTIVITA’ ALLERGENICA, TERATOGENA,
MUTAGENA ).
IN GENERALE SI PUÒ AFFERMARE CHE
L’ATTIVITÀ ANTIMICROBICA TENDE AD
DIMINUIRE DURANTE I PROCESSI DI
PREPARAZIONE DEGLI ALIMENTI ANCHE
SE ANCORA NON SI È IN GRADO DI
ESCLUDERE LA POSSIBILE FORMAZIONE
DI METABOLICI TOSSICI IN SEGUITO AI
DIVERSI PROCESSI.
AL GIORNO D’OGGI SI CONOSCONO E
VENGONO NORMALMENTE IMPIEGATE
DIVERSE METODICHE PER LA RICERCA DEI
RESIDUI DI FARMACI AD AZIONE
ANTIMICROBICA NEGLI ALIMENTI:
METODI BASATI SU:
•INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA
•TEST DEL RECETTORE MICROBICO
•TEST ENZIMATICO-COLORIMETRICI
•METODICHE CROMATOGRAFICHE
•TEST IMMUNOCHIMICI
ALCUNI TEST DANNO RISPOSTE DI TIPO
QUALITATIVO, ALTRE QUANTITATIVO,
ALTRE SEMIQUANTITATIVO.
TEST QUALITATIVI:
RICHIEDONO CHE SIA STABILITO UN VALORE
SOGLIA PER CLASSIFICARE I CAMPIONI
IN POSITIVI E NEGATIVI
( QUESTO VALORE DOVRÀ ESSERE DEFINITO
TENENDO CONTO DEI LMR ).
TEST QUANTITATIVI:
È NECESSARIO TESTARE UN CAMPIONE E
PARAGONARLO A VALORI DI RIFERIMENTO
CERTIFICATI CON CUI COSTRUIRE UNA
CURVA DI CALIBRAZIONE.
TEST SEMIQUANTITATIVI:
SONO SIMILI A QUELLI QUANTITATIVI MA
LE RISPOSTE NON SONO ESPRESSE COME
PRECISI VALORI DI CONCENTRAZIONE MA
COME RANGE DI CONCENTRAZIONE ( AD ES.
CAMPIONI NEGATIVI, DEBOLMENTE
POSITIVI, POSITIVI , MOLTO POSITIVI )
LA DIVERSITA’ DELLE METODICHE PUO’
ESSERE SFRUTTATA IMPIEGANDO I
DIVERSI TEST IN RAPPORTO ALLE
DIVERSE ESIGENZE
UNA METODICA CHE PERMETTE DI SAGGIARE UN
GRANDE NUMERO DI CAMPIONI, DANDO UN BASSO
NUMERO DI FALSI NEGATIVI E UN ACCETTABILE
NUMERO DI FALSI POSITIVI POTREBBE ESSERE
IL TEST DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA
MICROBICA.
UNA METODICA IN GRADO DI SVELARE IL
TIPO DI RESIDUO POTREBBE ESSERE IL
TEST IMMUNOENZIMATICO O
RECETTORIALE
PER LA CONFERMA DELLA POSITIVITA’ E
LA QUANTIFICAZIONE DEL RESIDUO
OCCORREREBBE UTILIZZARE METODI
QUANTITATIVI
TECNICHE CROMATOGRAFICHE
ASSOCIATE ALLA SPETTROMETRIA DI
MASSA PER UNA CONFERMA DI
CERTEZZA
(EU 93/256 “Methods based only on
chromatographic analysis without the use of
molecular spectometric detection are not
suitable for use as confirmatory methods”)
CONCENTREREMO LA NOSTRA
ATTENZIONE SU QUELLI PIU’
FREQUENTEMENTE UTILIZZATI IN
AMBITO VETERINARIO E IN
PARTICOLAR MODO NEGLI OVINI
ALLO SCOPO DI COMPARARE LA PERFORMANCE
DI DUE DIVERSI TEST PRESENTI SUL
MERCATO E DI DETERMINARE LA
SENSIBILITÀ DEI DUE TEST
( TEST 1 E TEST 2 ) AI PRINCIPALI PRINCIPI
ATTIVI
( PENICILLINA E TETRACICLINA ), IL
LABORATORIO ANALISI LATTE
DELL’ASSOCIAZIONE REGIONALE ALLEVATORI
DELLA SARDEGNA HA CONDOTTO NEL 2003
UNO STUDIO DI
VALIDAZIONE IN LATTE DI PECORA .
LO STUDIO ERA RIFERITO A 1165 CAMPIONI
DI LATTE OVINO DELLA RACCOLTA DI
ROUTINE NEL PERIODO
LUGLIO- AGOSTO 2003.
LA TOTALITÀ DEI CAMPIONI È STATA
ANALIZZATA CON DUE DIVERSI TEST
ENTRAMBI BASATI SULL’INIBIZIONE DELLA
CRESCITA MICROBICA, ED È STATA
ESEGUITA SIA UNA LETTURA VISIVA CHE
UNA SPETTROFOTOMETRICA
SONO STATI PRESI IN
CONSIDERAZIONE SIA I RISULTATI
POSITIVI E NEGATIVI
CHE QUELLI DUBBI O INTERMEDI
COMPARAZIONE DELLE PERFORMANCE IN
ROUTINE:
SI È REGISTRATO UN 100% DI
COINCIDENZA TRA I DUE TEST SUI
CAMPIONI POSITIVI,
CI SONO STATI 5 CASI CON RISULTATI
DISCORDANTI (+- vs. -) lo 0,4%
ALLO SCOPO DI DETERMINARE LA SENSIBILITÀ
AI DIVERSI ANTIBIOTICI SONO STATI
ADULTERATI DEI CAMPIONI DI LATTE CON 7
CONCENTRAZIONI DI PRINCIPI ATTIVI E
SONO STATI ANALIZZATI IN DOPPIO
CON I DUE TEST
I CAMPIONI DI LATTE PROVENIVANO DA
PECORE DI RAZZA SARDA DELL'AZIENDA
SPERIMENTALE DELL'IZCS DI BONASSAI
COMPLESSIVAMENTE 20 CAMPIONI 10 DELLA
MUNGITURA DELLA MATTINA E 10 DELLA SERA
CONCENTRAZIONE DI ANTIBIOTICO NEI
CAMPIONI CONTAMINATI
AGENTE ANTIMICROBICO
• PENICILLINA G
CONCENTRAZIONE (ppb)
0,1,2,3,4,5,6,7
• DIIDROSSISTREPTOMICINA
1000,2000,2500,3000,3500,4000,4
500
• SULFADIAZINA
0,20,40,60,80,100,120,140
• TETRACICLINA
0, 200, 250, 350, 450, 550, 650,
800
IL TEST 1 È RISULTATO PIÙ SENSIBILE DEL
TEST 2 NELLA RILEVAZIONE DELLA
TETRACICLINA SIA SUI CAMPIONI POSITIVI
CHE SU QUELLI “ NON NEGATIVI”.
SENSIBILITÀ
IN PPB SU LATTE
OVINO
TEST 2
TEST 1
TEST 2
TEST 1
POSITIVI
NON
NON
POSITIVI
NEGATIVI
NEGATIVI
PENICILLINA
2,97
2,48
2,97
2,50
TETRACICLINA
650
483
> 800
725
DETECTION LIMITS OF ANTIMICROBIALS IN EWE MILK BY DELVOTEST
PHOTOMETRIC MEASUREMENTS
( J. DAIRY SC. 2003 )
SENSIBILITÀ
IN PPB SU LATTE OVINO
AGENTE
LMR
ANTIMICROBICO
DETECTION
LIMIT
PENICILLINA G
1
4,00
TETRACICLINA
590
100
DAGLI STUDI DI SENSIBILITÀ È EMERSO
UN DATO IMPORTANTE PER ALTRO GIÀ
NOTO DA STUDI EFFETTUATI
PRECEDENTEMENTE SUL LATTE BOVINO
(M.BENEDETTI, G.VARISCO, G.BOLZONI: VALUTAZIONE DEI
LIMITI DI SENSIBILITÀ METODO MICROBIOLOGICO PER LA
DETERMINAZIONE DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE )
OGGI CON L’INTRODUZIONE DI SISTEMI
AUTOMATICI DI INCUBAZIONE E LETTURA E’
POSSIBILE MIGLIORARE LA SENSIBILITA’ DEL
METODO SENZA MODIFICHE DEL KIT DI
PARTENZA. (DI PROSSIMA PUBBLICAZIONE LAVORO SU
LATTE DI PECORA E CAPRA –AGRIS SARDEGNA)
MENTRE LA SENSIBILITÀ ALLA PENICILLINA
DEI TEST DI SCREENING E DEI TEST BASATI
SU SAGGIO ENZIMATICO RECETTORE
SPECIFICO ( ES. SNAP ) È AL DI SOTTO DEI
LMR, LA SENSIBILITÀ DEI TEST DI
SCREENING BASATI SULL’INIBIZIONE DELLA
CRESCITA MICROBICA ( ES DELVOTEST ) SI
RIVELA INADEGUATA ALLA RILEVAZIONE
DELLE TETRACICLINE.
( LMR 100 PPB TEST DI SCREENING LETTURA
> 650 PPB, BEN AL DI SOPRA DEI LIMITI
MASSIMI CONSENTITI. )
QUESTO SOPRATTUTTO IN CONSIDERAZIONE
DEL FATTO ESTREMAMENTE IMPORTANTE CHE
NELLA REALTÀ DELLA SARDEGNA PER IL LATTE
OVINO L’ANTIBIOTICO PIÙ LARGAMENTE
UTILIZZATO
(ANZI QUASI ESCLUSIVAMENTE )
È L’OSSITETRACICLINA
( DATI ESTRATTI DA INDAGINI SVOLTE DAI VETERINARI ARAS
PRESENTI SU TUTTO IL TERRITORIO REGIONALE)
SNAP TEST
SAGGIO ENZIMATICO RECETTORE SPECIFICO
CHE DETERMINA LA PRESENZA DI RESIDUI
DI PENICILLINA G O TETRACICLINA A
CONCENTRAZIONI UGUALI O INFERIORI AI
VALORI DI TOLLERANZA E /O DI SICUREZZA
IN LATTE DI MASSA NON TRATTATO
SENSIBILITA’ PENICILLINA G: 4 ppb
SENSIBILITA’ OSSITETRACICLINA 50 ppb
DALL’ANALISI DEI DATI RELATIVI AL LAVORO
DI CONFERMA CON LO SNAP TEST, DEI
RISULTATI POSITIVI O DUBBI AL DELVOTEST
EFFETTUATO DAL LABORATORIO ARAS NEL
PERIODO 2008-2009 SUL LATTE OVINO
EMERGONO I SEGUENTI DATI :
Latte Ovino
Annata
Numero
campioni
N°
campioni
++
2008/2009
45635
2007/2008
++
Numero
campioni
+-
+-
210
0,46
139
0,30
46535
144
0,30
94
0,20
2006/2007
47987
120
0,25
38
0,07
2005/2006
41333
90
0,21
44
0,10
2004/2005
40239
129
0,32
70
0,17
%
%
N° CAMPIONI OVINI ANALIZZATI CON IL
DELVOTEST
100.289
N° CAMPIONI POSITIVI
400 ( 0,40% )
N° CAMPIONI DUBBI
248 ( 0,25% )
N° CAMPIONI OVINI POSITIVI AL
DELVOTEST E
ANALIZZATI CON LO SNAP TEST:
400
N° CAMPIONI POSITIVI AI BETA LATTAMICI
:
211 ( 52,75 % )
N° CAMPIONI POSITIVI ALLE TETRACICLINE:
32 ( 8 % )
N° CAMPIONI OVINI INTERMEDI AL
DELVOTEST E
ANALIZZATI CON LO SNAP TEST:
248
N° CAMPIONI POSITIVI AI BETA LATTAMICI
:
50 ( 20,16% )
N° CAMPIONI POSITIVI ALLE
TETRACICLINE:
25 ( 11% )
TRA I CAMPIONI POSITIVI AL
DELVOTEST SI SONO VERIFICATI 4 CASI
NEI QUALI SONO RISULTATI POSITIVI
SIA AI BETA LATTAMICI CHE ALLE
TETRACICLINE CON LO SNAP TEST
DALL’ANALISI DEI DATI EMERGONO I SEGUENTI DUBBI :
QUALI SONO LE RAGIONI CHE GIUSTIFICANO UNA COSÌ
BASSA PERCENTUALE DI CAMPIONI POSITIVI ALLE
TETRACICLINE DAL MOMENTO CHE L’OSSITETRACICLINA È
L’ANTIBIOTICO PIÙ UTILIZZATO?
E’ UN PROBLEMA DI SENSIBILITÀ DEL METODO DI SCREENING
O PIUTTOSTO DIPENDE DALLE MODALITÀ DI UTILIZZO DEL
FARMACO ( SI FA PRESENTE CHE NEL CASO DEL LATTE
OVINO LA SOMMINISTRAZIONE È QUASI
ESCLUSIVAMENTE PARENTERALE ) E DELLA SUA
FARMACOCINETICA?
SE PROVASSIMO A ESEGUIRE IL TEST SNAP SULLA TOTALITÀ
DEI CAMPIONI
( ANCHE SU QUELLI NEGATIVI ) CI DOVREMMO ATTENDERE
UN INCREMENTO DELLA PERCENTUALE DI POSITIVITÀ ALLE
TETRACICLINE ?
E LE SEGUENTI NECESSITA’:
SAREBBERO NECESSARI STUDI SU CARRYOVER E UTILIZZO
DELLE TETRACICLINE NEI PICCOLI RUMINANTI IN MODO
DA DEFINIRE LA REALE CONSISTENZA DEL PROBLEMA
LA DISPONIBILITA’ DI UN BUON METODO DI CONFERMA
POTREBBE AIUTARE A RISOLVERE MOLTI DUBBI.