Marcatori molecolari
Caratteristiche e applicazioni
Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino
1
I marcatori molecolari
Strumento per l’analisi genetica
Strumento
 non oggetto di studio
Molecolari
 biologia molecolare
Analisi genetica
 studio delle differenze
genetiche
Marcatori
 approccio indiretto
2
Alcune definizioni
Marcatore genetico: Locus genico che identifica univocamente una
regione cromosomica
Mappa genetica:
Definisce le RELAZIONI LINEARI tra marcatori
molecolari
 E’ IL RISULTATO DELL’ANALISI GENETICA
Distanza genetica:
Stima della distanza esistente tra due marcatori
calcolata sulla frequenza di ricombinazione
- Si esprime in Centimorgan (cM)
- 1cM = 1 ricombinante / 100 prodotti meiotici
Polimorfismo:
Presenza di varianti alleliche per un dato gene o
marcatore
Polimorfismo molecolare: Differenze evidenziabili a livello di DNA
3
I marcatori molecolari sono
UNIVERSALI
4
I marcatori molecolari sono
EREDITABILI
5
I marcatori genetici
►
Marcatori morfologici
► Problemi:
►
1) non sono molto numerosi
2) dipendono dalla specie (ploidia ecc.)
Marcatori molecolari
► Identificano
polimorfismo a livello di DNA
► Offrono la possibilità di coprire tutto il genoma
► Sono applicabili universalmente
6
Marcatore genetico ideale
►
►
►
►
►
►
►
►
►
►
Non influenzato dall’ambiente
Neutrale
Stabile
Facile da monitorare
Numeroso
Codominante
Polimorfico
Presente in qualsiasi tessuto
Indipendente da sesso ed età
Analisi automatizzabile
N.B. Peccato che non ci sia !!
7
Tecniche per la produzione di
marcatori molecolari
►
Ibridazione molecolare
► Southern blot
 es. RFLP
►
Amplificazione del DNA
► PCR (Polymerase Chain Reaction)
 RAPD, SSR o STR
►
Approcci misti
► Digestione enzimatica e amplificazione
 CAPS, AFLP
8
I marcatori RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism)
9
La reazione a catena della
polimerasi (Polymerase Chain Reaction - PCR)
►
Inventata da Kary Mullis nel 1985
► Gli è valsa il Nobel nel 1993
Fondamenti:
►
Conoscenze sulla replicazione del DNA
- DNA polimerasi
►
Sintesi in vitro di DNA a sequenza specifica
- Oligonucleotidi
►
Biologia dei batteri estremofili
- DNA polimerasi Taq ricavata da Thermus aquaticus
10
I marcatori RAPD
(Random Amplified Polymorfic DNA)
►
►
►
►
►
►
►
Basati su PCR
Non sono necessari dati di sequenza
Automatizzabili
Oligonucleotidi (primer) sono corti e di sequenza casuale
Temperatura di annealing è bassa: 37°C
Richiedono poco DNA di partenza
La tecnica è facile
Problemi
►
Scarsa ripetibilità
►
Non sono locus-specifici
►
Non sono esportabili
►
Difficilmente confrontabili tra mappe e tra genotipi
►
Sono marcatori dominanti
11
Analisi RAPD di 9 varietà di
ciliegio
2000 bp
1500 bp
500 bp
1
2
3
4
5
6
7
8
9
M
I campioni 1 e 3 provengono dalla stessa varietà, così come i
campioni 2 e 6; nella corsia 9 è stato usato DNA di amareno
12
I microsatelliti o SSR
(Simple Sequence Repeat)
13
I microsatelliti o SSR
(Simple Sequence Repeat)
Individuo 1
Individuo 2
1
2
3
4
5
6
Individuo 3
Individuo 4
Individuo 5
Individuo 6
14
Analisi SSR di alcuni individui
di una popolazione naturale
Individui della popolazione
-
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
12
1
2
3
4
5
+
6
Quanti alleli distinguete negli individui di questa popolazione?
15
La tecnica degli AFLP
16
Esempio di gel AFLP
17
Analisi multiplex di marcatori
18
Gli SNP
(single nucleotide polymorphism)
...C C A T T G A C...
…G G T A A C T G...
...C C G T T G A C...
…G G C A A C T G...
Che cos’è uno SNP ?
• E’ una differenza, o polimorfismo, di un
singolo nucleotide nella sequenza di
DNA esistente in alcuni individui della
stessa specie.
• Il loro numero varia notevolmente a
seconda della specie
 In uomo c’è in media uno SNP
ogni 300 nucleotidi
19
Perché utilizzare gli SNPs
► Sono
la base molecolare della maggior
parte delle differenze tra individui
► Possono
contribuire alla suscettibilità a
malattie e all’adattabilità delle specie
► Sono
presenti in un elevato numero e sono
distribuiti lungo tutto il genoma
20
Impieghi dei marcatori molecolari
►
Analisi di paternità
►
Diagnosi di anomalie genetiche
►
Analisi forensi
►
Identificazione di QTL e geni utili
►
Miglioramento delle specie vegetali ed animali
►
Studio della struttura, evoluzione e biodiversità delle
popolazioni
►
Studi di epidemiologia
►
Tracciabilità dei prodotti animali e/o dei GMO
►
Conservazione della natura
►
Studi di filogenesi ed evoluzione
21
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/
22
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi
23
Programma di queste esercitazioni
►
LUNEDÌ
►
►
►
Introduzione sui marcatori molecolari e loro usi
Estrazione del vostro DNA dalle cellule della mucosa
boccale
MARTEDÌ
►
►
Spiegazione teorica sulla PCR e sull’uso che ne faremo
Amplificazione specifica di tre sequenze del vostro genoma
Marcatore altamente polimorfico D1S80 sul cromosoma 1
2. Marcatore Y-GATA-A7.2 sul cromosoma Y
3. Marcatore HUAMEL sul gene dell’amelogenina sulla
regione omologa dei cromosomi X e Y
1.
►
►
Preparazione dei gel di agarosio
MERCOLEDÌ
►
►
►
Elettroforesi dei prodotti di PCR sul gel di agarosio
Protocollo semplificato per l’estrazione di DNA da Kiwi
Analisi e discussione dei risultati ottenuti
24