Spettrometria di Massa
Cos’è uno spettrometro di massa
Lo spettrometro di massa è uno strumento che
produce ioni e li separa in fase gassosa in
base al loro rapporto massa/carica (m/z).
Un’analisi mass spettrometrica può essere
rappresentata dai seguenti passaggi:
Introduzione del campione – Ionizzazione –
Analisi della massa – Rivelazione degli
ioni/analisi dei dati.
Scopi della spettrometria di massa
• Determinazione del peso molecolare
• Delucidazione della struttura molecolare
• Identificazione di componenti di una
miscela
• Indagini quantitative
• Studi meccanicistici
• Studio di interazioni intermolecolari
Aree di interesse
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•
Proteomica
Glicobiologia
Genetica e medicina
Biologia molecolare e cellulare
Scienze ambientali
Chimica dei polimeri
Antiterrorismo
Farmacologia
Antidoping
Archeologia
Astronomia
Analisi inorganica
…e ancora tante altre
Caratteristiche della spettrometria di
massa
• Intervallo di PM fino a centinaia di kDa
• Sensibilità dell’ordine delle picomoli o
inferiore
• Acquisizione veloce dei dati
• Interfacce con metodi separativi
• Alta e bassa risoluzione
Spettrometria di massa
Le molecole sono molto piccole! Ci vogliono approsimativamente
600.000.000.000.000.000.000.000 molecole di acqua per fare un grammo! Per pesare le
molecole conviene usare il dalton (Da).
1 Da corrisponde alla dodicesima parte dell'atomo di carbonio (12C). In questa scala
l'ossigeno (16O) pesa 15,9949 e l'idrogeno (1H) pesa 1,00782. L'acqua pesa quindi circa
18 (18,0104541).
Alcune definizioni
Massa Nominale:
e' coincidente con il numero di protoni e neutroni che contiene l'isotopo. Lo spettrometro di massa misura il
rapporto massa/carica degli ioni: e' quindi in grado di distinguere i singoli isotopi di ciascun elemento.
Massa Esatta:
e' la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con la somma delle masse esatte dei protoni e
neutroni contenuti, ma e' determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura e' ottenuta
ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo 12C.
Peso Atomico:
(quello usato in stechiometria, per intendersi): e' la media ponderale delle masse esatte degli isotopi
presenti in natura di quel particolare elemento.
Relative Isotope Abundance of Common Elements:
Element
Isotope
Carbon
Hydrogen
Nitrogen
Oxygen
Sulfur
Chlorine
Bromine
12C
1H
14N
16O
32S
35Cl
79Br
Relative
Abundance
100
100
100
100
100
100
100
Isotope
13C
2H
15N
17O
33S
Relative
Abundance
1.11
.016
.38
.04
.78
Isotope
18O
34S
37Cl
81Br
Relative
Abundance
.20
4.40
32.5
98.0
Quali sono i componenti di uno
spettrometro di massa?
Sistema di
introduzione
rivelatore
analizzatore
Sorgente
ionica
Spettro di massa
Modalità di ionizzazione
Hard Ionization:
• Ionizzazione elettronica
– Electron Ionization (EI)
Soft Ionization:
• Ionizzazione chimica
– Chemical Ionization (CI)
• Bombardamento con atomi veloci
– Fast Atom Bombardment (FAB)
• Ionizzazione termospray
– Thermospray Ionization (TSP)
• Ionizzazione elettrospray
– Electrospray Ionization (ESI)
• Ionizzazione chimica a pressione atmosferica
– Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
• Desorbimento laser assistito da matrice
– Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)
 Lo ione molecolare può non essere
visibile
 Eccessiva frammentazione
 La sostanza deve essere volatilizzata
Gli ioni sono accelerati da un intenso
potenziale elettrostatico verso l’analizzatore.
Un campo magnetico è in grado di far
deviare particelle cariche in movimento,
per cui gli ioni provenienti dalla sorgente
possono seguire la curvatura del tubo.
L’entità della deviazione dipende
dall’intensità del campo magnetico,
dall’energia fornita dal potenziale
elettrostatico e dal rapporto m/z dello ione.
In particolare per ogni valore di potenziale
elettrostatico e campo magnetico, solo ioni
con un ben preciso rapporto m/z
riusciranno ad attraversare la fenditura
posta alla fine dell’analizzatore, ed arrivare
quindi al collettore di ioni, che genera un
segnale elettrico dipendente dall’intensità
della corrente ionica che lo colpisce.
L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono
presenti quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione
circolare oppure iperbolica. Le barre diametralmente opposte sono in contatto elettrico tra di
loro, mentre tra barre adiacenti è applicata un voltaggio formato da due componenti: una
differenza di potenziale continua e una oscillante ad alta frequenza. Lo ione entra
nell'analizzatore parallelamente all'asse z, ed è spinto dai campi elettrici continuo e
oscillante a seguire una traiettoria a spirale.
Peso molecolare della sostanza sotto indagine
Frammentazioni
Picchi isotopici: HCl
H35Cl
MW 36
(75%)
H37Cl
MW 38
(25%)
BILANCIA
6.021023 molecole
= 1 mol
= 36.55 g
Sorg.
Analizzatore
MS
m/z 36 m/z 38
(75%)
(25%)
Picchi isotopici: EtOH
13CH
CH3CH2OH
MW 46
3CH2OH
MW 47
1.1%
CH313CH2OH
MW 47
1.1%
Sorg.
BILANCIA
MS
Analizzatore
m/z 46
m/z 47
(2.2 %)
6.021023 molecole
= 1 mol
= 46.07 g
Picchi isotopici
M+1
M+2
1.1%(numero di C)+ 0.36%(numero di N)
Cl
(33% di M)
Br (100% di M)
S
(4% di M)
Sorgente FAB
Sorgente MALDI
Sorgente ESI
Non richiedono volatilizzazione
The Nobel Prize in
Chemistry 2002
“For the development of methods
for identification and structures
analysis of biomolecules”
Electrospray Ionization
Laser Desorption
Ionizzazione Elettrospray
(ESI)
Ionizzazione elettrospray
• Tecnica di ionizzazione in fase liquida a pressione
atmosferica
• Ionizzazione delicata
• Molecole di polarità medio-alta
• Composti con basso ed alto PM fino a 150.000
• Spesso si formano ioni con carica multipla
• Comune la presenza di ioni addotto
• La fase mobile deve essere polare
Dettaglio dell’ugello elettrospray
Guaina di N2
Sonda riscaldata ESI
±5 kV
Gas di
nebulizzazione N2
Pennacchio di ioni
Ago ESI
Meccanismo dell’elettrospray
Goccioline
contenenti ioni
Capillare
±5 kV
Col procedere
dell’evaporazione delle
goccioline, il campo aumenta e
gli ioni si muovono verso la
Raggiungimento del
superficie
limite di Raleigh ed
esplosione coulombica
che rilascia gli ioni
Ionizzazione elettrospray
Ionizzazione elettrospray
ESI-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da)
+12
715.99
+13
661.26
+11
786.97
+10
859.66
+9
955.00
+8
1073.07
 Nessuna Frammentazione
 Formazione di Ioni Multicarica
Spettro Deconvoluto dell’Ubiquitina
Ubiquitina Ossidata
8580.00
Ubiquitina Intatta
8563.63
Ubiquitina Carbossilata
8594.25
Prestazioni Generali della Sorgente ESI
Vantaggi
Svantaggi
 Funziona bene con analiti volatili e non
volatili, ionici e/o polari
Scarsa frammentazione
 Informazioni sul peso molecolare
 Scarsa frammentazione
 Elevata sensibilità
 Permette la determinazione di alti pesi
molecolari
 Interfacciamento con Cromatografia
Liquida
Non compatibile con l’utilizzo di
tamponi non volatili e solventi
organici apolari.
Ionizzazione inibita da alte
concentrazioni saline
Ionizzazione Laser Assistita da
Matrice
(MALDI)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
MALDI
Il desorbimento mediante laser permette di ottenere
ioni in fase gassosa.
Le pulsazioni provenienti da un laser a 106-1010
W/cm2 sono focalizzate sulla superficie del
campione solido.
Le pulsazioni estraggono materiale dalla superficie e
creano un microplasma di ioni e di molecole
neutre che possono reagire tra di loro in fase
vapore.
Le pulsazioni laser sono in grado sia di vaporizzare
sia di ionizzare il campione.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
MALDI
Principi operativi
I passaggio: il composto è mescolato ad una
matrice che assorbe intensamente la
lunghezza d’onda del laser. La miscela è
asciugata e qualunque solvente rimosso. Ne
risulta una soluzione solida costituita da
analita e cristalli di matrice.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
MALDI
II passaggio: le pulsazioni estraggono la soluzione
solida ed inducono il riscaldamento della
soluzione e la sublimazione della matrice. Una
certa energia è trasferita alle molecole di analita
che si ionizzano.
Il MALDI permette il desorbimento e la ionizzazione
di analiti ad altissimo PM (>100000 Da). E’ usato
nell’analisi di proteine ad alto PM, polimeri e
biopolimeri.
1. Sample is mixed with matrix
and dried on a sample plate
2. Sample plate is introduced
into MALDI source
3. Sample spot is irradiated
with laser
+
+
+
+
+
+
+
To Time of Flight
MALDI PROCESS
Irradiation
Desolvation
Desorption
H+
Matrix
Sample
Proton transfer
Sample Molecules are
ionized by proton
transfer from the
matrix
MALDI-TOF Spectrum of Cytocrome C,
Ubiquitin and Myoglobin
Matrix Selection
Solubility in sample-solvent
system
Absorption at the laser wavelenght
Photostability
Volatility
Reactivity
Matrix
Application
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid
(CHCA)
Peptides (<10 KDa), lipids, carbohydrates
Sinapinic acid (SA)
Peptides and large
membrane proteins
Gentisic acid
Peptides, proteins, carbohydrates, glycoproteins, glycolipids,
polymers, lipids, organic molecules
Trans-3-indoleacrylic acid (IAA)
Synthetic polymers
3-hydroxypicolinic acid (HPA)
Oligonulceotides > 3.5KDa
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)
Oligonucleotides < 3.5KDa
Dithranol (DIT)
Polymers
proteins
(10-150KDa),
glycoproteins,
Prestazioni Generali della Sorgente MALDI
Vantaggi:
 Analisi di composti con un PM oltre 300000 Da
 Alta Sensibilità (da 100 fmol a 2 pmol)
 No Ioni multicarica
 Tolleranza alla presenza di sali, tamponi o altri
additivi
 Analisi di miscele complesse
Svantaggi:
 Analisi di composti con un PM sotto i 600 Da è
difficile
 La risoluzione dell’analizzatore TOF è limitata
 No analisi di complessi non-covalenti
 Accoppiamento On-line con un LC or CE è molto
difficile.
Paragone tra tecniche di
ionizzazione MS
200,000
ESI
15,000
1,000
PM
FAB
EI/CI
10
NON POLARE
MOLTO POLARE