Spettrometria di Massa
Cos’è uno spettrometro di massa
Lo spettrometro di massa è uno strumento che
produce ioni e li separa in fase gassosa in
base al loro rapporto massa/carica (m/z).
Un’analisi mass spettrometrica può essere
rappresentata dai seguenti passaggi:
Introduzione del campione – Ionizzazione –
Analisi della massa – Rivelazione degli
ioni/analisi dei dati.
Scopi della spettrometria di massa
• Determinazione del peso molecolare
• Delucidazione della struttura molecolare
• Identificazione di componenti di una
miscela
• Indagini quantitative
• Studi meccanicistici
• Studio di interazioni intermolecolari
Aree di interesse
•
•
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•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Proteomica
Glicobiologia
Genetica e medicina
Biologia molecolare e cellulare
Scienze ambientali
Chimica dei polimeri
Antiterrorismo
Farmacologia
Antidoping
Archeologia
Astronomia
Analisi inorganica
…e ancora tante altre
Caratteristiche della spettrometria di
massa
• Intervallo di PM fino a centinaia di kDa
• Sensibilità dell’ordine delle picomoli o
inferiore
• Acquisizione veloce dei dati
• Interfacce con metodi separativi
• Alta e bassa risoluzione
Spettrometria di massa
Le molecole sono molto piccole! Ci vogliono approsimativamente
600.000.000.000.000.000.000.000 molecole di acqua per fare un grammo! Per pesare le
molecole conviene usare il dalton (Da).
1 Da corrisponde alla dodicesima parte dell'atomo di carbonio (12C). In questa scala
l'ossigeno (16O) pesa 15,9949 e l'idrogeno (1H) pesa 1,00782. L'acqua pesa quindi circa
18 (18,0104541).
Alcune definizioni
Massa Nominale:
e' coincidente con il numero di protoni e neutroni che contiene l'isotopo. Lo spettrometro di massa misura il
rapporto massa/carica degli ioni: e' quindi in grado di distinguere i singoli isotopi di ciascun elemento.
Massa Esatta:
e' la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con la somma delle masse esatte dei protoni e
neutroni contenuti, ma e' determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura e' ottenuta
ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo 12C.
Peso Atomico:
(quello usato in stechiometria, per intendersi): e' la media ponderale delle masse esatte degli isotopi
presenti in natura di quel particolare elemento.
Relative Isotope Abundance of Common Elements:
Element
Isotope
Carbon
Hydrogen
Nitrogen
Oxygen
Sulfur
Chlorine
Bromine
12C
1H
14N
16O
32S
35Cl
79Br
Relative
Abundance
100
100
100
100
100
100
100
Isotope
13C
2H
15N
17O
33S
Relative
Abundance
1.11
.016
.38
.04
.78
Isotope
18O
34S
37Cl
81Br
Relative
Abundance
.20
4.40
32.5
98.0
Quali sono i componenti di uno
spettrometro di massa?
Sistema di introduzione
rivelatore
Sorgente ionica
analizzatore
Spettro di massa
Modalità di ionizzazione
Hard Ionization:
• Ionizzazione elettronica
– Electron Ionization (EI)
Soft Ionization:
• Ionizzazione chimica
– Chemical Ionization (CI)
• Bombardamento con atomi veloci
– Fast Atom Bombardment (FAB)
• Ionizzazione termospray
– Thermospray Ionization (TSP)
• Ionizzazione elettrospray
– Electrospray Ionization (ESI)
• Ionizzazione chimica a pressione atmosferica
– Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
• Desorbimento laser assistito da matrice
– Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)
Ionizzazione Elettronica
Sorgente ionizzazione elettronica
(EI)
Ionizzazione elettronica (EI)
Nella camera di ionizzazione le molecole del campione da analizzare, in fase gassosa, interagiscono con un
fascio di elettroni generato da un filamento incandescente (Renio o Tugsteno) ed accelerato attraverso un
potenziale regolabile dall'operatore. L'energia del fascio e' normalmente fissata a 70 eV.
La relazione tra il momento di un elettrone - considerato come particella - e la sua lunghezza d'onda e' fornita
dall'equazione di De Broglie:
lambda=h/mv
Agli elettroni di 70 eV impiegati per la ionizzazione puo' quindi essere associata una lunghezza d'onda di ca. 1.4
Å.
Durante l'avvicinamento degli elettroni alla molecola bersaglio, l'onda elettronica ed il campo elettrico molecolare
interagiscono tra di loro con una mutua distorsione. L'onda elettronica distorta puo' esere considerata composta
da un insieme di radiazioni di differente lunghezza d'onda, alcune delle quali hanno la frequenza corretta per
interagire con gli elettroni della molecola.
In termini quantomeccanici l'impatto elettronico puo' quindi promuovere eccitazioni elettroniche simili a quelle
osservate nella spettroscopia UV, fino ad ottenere anche l'espulsione di un elettrone dalla molecola con
formazione di uno ione radicale positivo, lo Ione Molecolare M(.+):
e- + M ---> M.+ + 2e-
Interpretazione dello spettro di massa
Nella comune pratica di laboratorio, si suggerisce prima di tutto di eseguire un confronto
computerizzato dello spettro appena registrato con il vasto archivio di spettri ormai disponibile su
tutti gli spettrometri commerciali. Anche se la molecola esaminata non e' compresa nell'archivio,
l'elaboratore elenca una serie di composti che contengono il maggior numero possibile di ioni
comuni con lo spettro incognito. L'identificazione di ioni caratteristici e' uno stadio importante anche
nell'interpretazione "manuale" degli spettri di massa: l'aiuto di un computer quindi non guasta.
Nell'interpretazione non assistita, normalmente si segue una procedura abbastanza semplice:
1.Identificazione dello ione molecolare.
2.Identificazione di ioni caratteristici.
3.Identificazione di processi di frammentazione caratteristici.
Ione molecolare
E' lo ione (positivo) generato per ionizzazione della molecola da analizzare. Dopo ionizzazione per impatto elettronico e' una
specie a numero dispari di elettroni:
M + e- ----> M*+ + 2eNon necessariamente e' osservabile nello spettro. Ad esempio negli alcoli alifatici a lunga catena e' di regola assente. Spesso
e'
possibile osservare ioni molecolari piu' intensi riducendo l'energia del fascio elettronico di ionizzazione. Metodi alternativi di
ionizzazione producono ioni molecolari piu' intensi e relativamente meno ioni frammento.
Lavorando ad alta risoluzione, la massa esatta dello ione molecolare fornisce direttamente la composizione elementare del
composto incognito.
Esistono delle regole generali:
- E' lo ione a massa più alta dello spettro.
- E' legato ad altri ioni attraverso perdite logiche
- Se la molecola contiene solamente C, H, O, S, Alogeni o un numero pari di atomi di azoto, lo ione molecolare e' di
massa nominale pari.
- Se la molecola contiene un numero dispari di atomi di azoto,
la massa nominale dello ione molecolare e' dispari.
Spettro di massa
Picco Base
O
CH3
m/z 43
- 15
CH2
m/z 57
Ione Molecolare
- 29
C
CH3
Librerie di Spettri di Massa
Universal
Application Oriented
Wiley
Pfleger/Maurer/Weber:toxicology
NIST
Zamecnik (TX)): toxicology
Adams: terpenes and fragrances
Ockels: pesticides
Spiteller: steroids
Le Maggiori Collezioni di Spettri in
Commercio
• NIST02: 147198 spettri
• Wiley 7: 338322 spettri
• Wiley7/NIST02 combinate: 425000 spettri
Ionizzazione elettronica (EI)
Vantaggi
Spettri ben interpretabili
La frammentazione fornisce informazioni di
tipo strutturale
Gli spettri sono riproducibili
Svantaggi
Per alcuni composti lo ione molecolare puo’ essere poco
rappresentato o addirittua assente
Applicabile solo a composti volatili, termostabili, neutri e
con peso molecolare non elevato
Modalità di ionizzazione
Hard Ionization:
• Ionizzazione elettronica
– Electron Ionization (EI)
Soft Ionization:
• Ionizzazione chimica
– Chemical Ionization (CI)
• Bombardamento con atomi veloci
– Fast Atom Bombardment (FAB)
• Ionizzazione termospray
– Thermospray Ionization (TSP)
• Ionizzazione elettrospray
– Electrospray Ionization (ESI)
• Ionizzazione chimica a pressione atmosferica
– Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
• Desorbimento laser assistito da matrice
– Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)
Ionizzazione Chimica
(CI)
Ionizzazione chimica
Generalmente in uno spettrometro di massa la pressione e' mantenuta la piu' bassa
possibile con efficienti sistemi di pompaggio (10-4 - 10-7 mmHg), e reazioni bimolecolari
(es. ione-molecola) sono estremamente improbabili.
La ionizzazione chimica avviene invece se introduciamo nella camera di ionizzazione un
gas reagente, ad esempio metano, in concentrazioni relativamente elevate (1 mmHg).
Lo ione molecolare del metano generato per impatto elettronico puo' reagire con l'eccesso
di metano:
Il catione CH5+, è un acido forte, puo' quindi protonare con una reazione acido-base
praticamente qualsiasi molecola organica.
Questa tecnica di ionizzazione genera uno ione pseudomolecolare (M+H)+ con un
bassissimo eccesso di energia vibrazionale, e le reazioni di frammentazione sono quindi
poco importanti.
M•+
[M+H]+
Modalità di ionizzazione
Hard Ionization:
• Ionizzazione elettronica
– Electron Ionization (EI)
Soft Ionization:
• Ionizzazione chimica
– Chemical Ionization (CI)
• Bombardamento con atomi veloci
– Fast Atom Bombardment (FAB)
• Ionizzazione termospray
– Thermospray Ionization (TSP)
• Ionizzazione elettrospray
– Electrospray Ionization (ESI)
• Ionizzazione chimica a pressione atmosferica
– Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
• Desorbimento laser assistito da matrice
– Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)
The Nobel Prize in
Chemistry 2002
“For the development of methods
for identification and structures
analysis of biomolecules”
Electrospray Ionization
Laser Desorption
Ionizzazione Elettrospray
(ESI)
Ionizzazione elettrospray
• Tecnica di ionizzazione in fase liquida a pressione
atmosferica
• Ionizzazione delicata
• Molecole di polarità medio-alta
• Composti con basso ed alto PM fino a 150.000
• Spesso si formano ioni con carica multipla
• Comune la presenza di ioni addotto
• La fase mobile deve essere polare
Dettaglio dell’ugello elettrospray
Guaina di N2
Sonda riscaldata ESI
±5 kV
Gas di
nebulizzazione N2
Pennacchio di ioni
Ago ESI
Meccanismo dell’elettrospray
Goccioline
contenenti ioni
Capillare
±5 kV
Col procedere dell’evaporazione
delle goccioline, il campo
aumenta e gli ioni si muovono
verso la superficie
Raggiungimento del
limite di Raleigh ed
esplosione coulombica
che rilascia gli ioni
Ionizzazione elettrospray
Ionizzazione elettrospray
ESI-MS Spectrum of Metamidophos
[M+Na]+
164
100
95
[M+K]+
90
181
85
80
[M+H]+
75
142
70
65
60
Ione
Pseudomolecolare
55
%
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
100
150
200
250
300
350
400
m/z
 Nessuna Frammentazione
 Formazione di Addotti con ioni Na e K
450
500
EI-MS Spectrum of Metamidophos
94
100
50
47
141
64
15
0
18
30
28 33
79
10
20
30
40
50
Phosphoramidothioic acid, O,S-dimethyl ester
60
70
80
90
126
111
92
42
100
110
120
130
143
140
ESI-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da)
+12
715.99
+13
661.26
+11
786.97
+10
859.66
+9
955.00
+8
1073.07
 Nessuna Frammentazione
 Formazione di Ioni Multicarica
Spettro Deconvoluto dell’Ubiquitina
Ubiquitina Ossidata
8580.00
Ubiquitina Intatta
8563.63
Ubiquitina Carbossilata
8594.25
Prestazioni Generali della Sorgente ESI
Vantaggi
Svantaggi
 Funziona bene con analiti volatili e non
volatili, ionici e/o polari
Scarsa frammentazione
 Informazioni sul peso molecolare
 Scarsa frammentazione
 Elevata sensibilità
 Permette la determinazione di alti pesi
molecolari
 Interfacciamento con Cromatografia
Liquida
Non compatibile con l’utilizzo di
tamponi non volatili e solventi
organici apolari.
Ionizzazione inibita da alte
concentrazioni saline
Ionizzazione Chimica a Pressione
Atmosferica
(APCI)
Ionizzazione chimica a
pressione atmosferica
• Composti a più basso peso molecolare
PM <1000
• Formazione di ioni con carica singola
• Più energetica
–Maggiore potenzialità di frammentazione
• La fase mobile può essere non polare
–Cromatografia in fase normale
• Sono favoriti i composti con bassa
polarità
Atmospheric Pressure Chemical
Ionization (APCI)
• La APCI sfrutta i vapori di solvente che
accompagnano l’analita durante l’eluizione
cromatografica dopo un rapido riscaldamento,
per produrre su di essi la prima ionizzazione
mediante un elettrodo a corona.
• Le molecole di solvente ionizzate si comportano
poi da reagente per la ionizzazione chimica degli
analiti, in modo analogo a quanto avviene per la
ionizzazione chimica tradizionale in GC-MS.
Meccanismo di generazione
degli ioni in APCI
Nebulizzatore
riscaldato
Molecole del solvente
Molecole del campione
Trasferimento di carica
N2
Liquido
+
+
N2
+
+
+
+
Ago
corona
Aerosol
Molecole del
campione solvatate
Solvente
ionizzato
Campione
ionizzato
Dettaglio dell’ugello APCI
Ago corona
±5 kV
Guaina
gassosa N2
Sonda riscaldata APCI
Gas di
nebulizzazione N2
Pennacchio ioni
Capillare APCI (ritratto)
Plasma ioni
“Corona Discharge”
Meccanismo Ioni Positivi
• L’ago cattura elettroni
formando ioni N2+, O2+, H2O+…
(ioni primari).
• Gli ioni primari, aventi un
tempo di vita molto breve,
trasferiscono la carica al
solvente, formando
principalmente ioni H3O+,
NH4+, RH2O+…(ioni reagenti).
• Gli ioni reagenti trasferiscono
la carica all’analita, formando
prevalentemente specie
[M+H]+.
“Corona Discharge”
Meccanismo Ioni Negativi
• L’ago rilascia elettroni
formando ioni O3-, O2-, NO2-,
CO3-…(ioni primari).
• Gli ioni primari, aventi un
tempo di vita molto breve,
trasferiscono la carica al
solvente, formando
principalmente ioni OH-,
HCO3-, RO-… (ioni reagenti).
• Gli ioni reagenti
trasferiscono la carica
all’analita formando
prevalentemente specie
[M-H]-.
ESI-APCI: confronto del processo
di ionizzazione
APCI: sommario delle
caratteristiche
• La APCI è adatta a composti anche non particolarmente
polari, che possono essere in forma ionica in soluzione,
ma non sono tipicamente acidi o basi forti.
• Il pH non ha una grossa influenza sulla risposta.
• Il flusso utilizzabile in APCI va da 0.2 a 2 ml/min. Un
tipico flusso operativo è 1 ml/min.
• In condizioni APCI il parametro da fissare è la corrente di
scarica, generalmente limitata a 2-3 µA. Questo valore
induce un voltaggio sull’ago paragonabile a quello
normalmente impiegato per la ionizzazione electrospray.
• La APCI non porta in nessun caso alla formazione di ioni
multicarica.
Campo di applicazione
• Composti di bassa o media polarità, volatili
o semivolatili.
• In certi casi la APCI offre una sensibilità
maggiore dell’ESI, specialmente quando
vengono utilizzati tamponi.
• In generale, la APCI può essere
considerata complementare rispetto
all’ESI e all’APPI.
Fast Atom Bombardment (FAB) e Secondary
Ion Mass Spectrometry (SIMS)
FAB e SIMS sono tecniche in cui il campione è
bombardato da una corrente di atomi/molecole
neutri oppure di ioni.
E’ indispensabile che il campione sia sciolto in una
matrice.
Questa è una tecnica eccellente per l’analisi in tracce
ed è usata nall’analisi dei peptidi, nucleotidi,
carboidrati e piccole molecole polari.
Ionizzazione Laser Assistita da
Matrice
(MALDI)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
MALDI
Il desorbimento mediante laser permette di ottenere
ioni in fase gassosa.
Le pulsazioni provenienti da un laser a 106-1010
W/cm2 sono focalizzate sulla superficie del
campione solido.
Le pulsazioni estraggono materiale dalla superficie e
creano un microplasma di ioni e di molecole
neutre che possono reagire tra di loro in fase
vapore.
Le pulsazioni laser sono in grado sia di vaporizzare
sia di ionizzare il campione.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
MALDI
Principi operativi
I passaggio: il composto è mescolato ad una
matrice che assorbe intensamente la
lunghezza d’onda del laser. La miscela è
asciugata e qualunque solvente rimosso. Ne
risulta una soluzione solida costituita da
analita e cristalli di matrice.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
MALDI
II passaggio: le pulsazioni estraggono la soluzione
solida ed inducono il riscaldamento della
soluzione e la sublimazione della matrice. Una
certa energia è trasferita alle molecole di analita
che si ionizzano.
Il MALDI permette il desorbimento e la ionizzazione
di analiti ad altissimo PM (>100000 Da). E’ usato
nell’analisi di proteine ad alto PM, polimeri e
biopolimeri.
1. Sample is mixed with matrix
and dried on a sample plate
2. Sample plate is introduced
into MALDI source
3. Sample spot is irradiated
with laser
+
+
+
+
+
+
+
To Time of Flight
MALDI PROCESS
Irradiation
Desolvation
Desorption
H+
Matrix
Sample
Proton transfer
Sample Molecules are
ionized by proton
transfer from the
matrix
MALDI-TOF Spectrum of Cytocrome C,
Ubiquitin and Myoglobin
Matrix Selection
Solubility in sample-solvent
system
Absorption at the laser wavelenght
Photostability
Volatility
Reactivity
Matrix
Application
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid
(CHCA)
Peptides (<10 KDa), lipids, carbohydrates
Sinapinic acid (SA)
Peptides and large
membrane proteins
Gentisic acid
Peptides, proteins, carbohydrates, glycoproteins, glycolipids,
polymers, lipids, organic molecules
Trans-3-indoleacrylic acid (IAA)
Synthetic polymers
3-hydroxypicolinic acid (HPA)
Oligonulceotides > 3.5KDa
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)
Oligonucleotides < 3.5KDa
Dithranol (DIT)
Polymers
proteins
(10-150KDa),
glycoproteins,
Prestazioni Generali della Sorgente MALDI
Advantages:
 Analysis of compounds with a MW in excess of
300000 Da
 High Sensitivity (from 100 fmol to 2 pmol
 No multicharged Ions
 Tolerance towards the presence of salts,
buffers, and or other additives
 Analysis of complex mixtures
Disadvantages:
 Analysis of compounds with a MW below 600 Da
is difficult
 The resolution of TOF mass analyzer is limited
 No analysis of non-covalent complexes
 On-line coupling with an LC or CE equipment is
very difficult.
Paragone tra tecniche di
ionizzazione MS
200,000
ESI
15,000
1,000
APCI
PM
FAB
EI/CI
10
NON POLARE
MOLTO POLARE