Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti
determinato mediante imaging vibrazionale
FACOLTÀ DI SCIENZE
MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN FISICA
Relatore:
Prof. Tullio Scopigno
Correlatore: Dott.ssa Abigail Nunn
Candidato:
Saltarelli Francesco
Anno Accademico 2013/14
Roma, 26 Settembre 2014
Introduzione
Negli epatociti vi può essere un
accumulo anomalo di lipidi sotto forma
di goccioline:
• dovuto a patologie (steatosi
epatica, cancro)
• indotto esternamente (acido oleico,
entinostat)
Healthy liver
Fatty liver
Attraverso degli script in ambiente Matlab
andremo ad analizzare la disposizione di tali
goccioline seguendo le fasi indicate:
1.
Acquisizione
2.
Processing
3.
4.
Analisi statistica di accumulo lipidico in
epatociti determinato mediante imaging
vibrazionale
•
Threshold e Watershed
•
Identificazione delle gocce in 3D
Calcolo funzione di distribuzione radiale
•
𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
•
Problema PBC
•
Test su simulazione LJ
•
Correzione 𝑔(𝑟)/ 𝑔(𝑑)
Applicazione a immagini acquisite
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
Diffusione a singolo fotone da
parte di una molecola:
• Elastica
→
Rayleigh
• Anelastica → Raman
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
Diffusione a più fotoni:
• CARS (Coherent AntiStokes Raman Scattering):
𝜔𝑎𝑠 = 2 ⋅ 𝜔𝑝 − 𝜔𝑠
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
Nei lipidi si sfrutta la riga
vibrazionale di stretching del
legame 𝐶𝐻 a:
𝜔𝑝 − 𝜔𝑠 = Ω = 2841𝑐𝑚−1
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epatociti determinato mediante imaging
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FASI DELL’ANALISI:
Schema microscopio invertito CARS
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔 𝑟 / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
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epatociti determinato mediante imaging
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FASI DELL’ANALISI:
Stack di immagini associato ad una cellula
(trattamento: acido oleico + entinostat)
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
Nella fase di processing otteniamo dallo stack
di immagini acquisite al microscopio posizione
e area di ogni goccia per ogni layer
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
Threshold: si fissano due soglie, i pixel con
un'intensità al loro interno rappresentano il
segnale, gli altri lo sfondo nero
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
Watershed: divide le gocce rimaste unite
cercando il loro centro e dilatandolo finche’
incontra un’altra goccia o raggiunge il limite
della goccia stessa a cui il centro appartiene
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
3D Iterative Thresholding
plugin: sceglie una soglia di
threshold diversa per ogni
goccia seguendola sull’intero
stack di immagini e tiene quella
che massimizza il volume
Il plugin esterno ha prestazioni migliori in termini di capacità di
distinguere le gocce e stimarne le dimensioni
Algoritmo interno Fiji: si fissa
una soglia di threshold uguale
per l’intero stack e poi si
esegue il watershed
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
Inseguimento di una goccia:
Dato un certo layer 𝑙 e su di esso una goccia 𝑖 si va a calcolare per
ogni goccia 𝑗 sul layer seguente più interno la quantità:
2. Processing
𝑙
𝑑𝑖,𝑗
=
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
𝑥𝑖𝑙 − 𝑥𝑗𝑙+1
2
+ 𝑦𝑖𝑙 − 𝑦𝑗𝑙+1
2
(𝑟𝑖𝑙 + 𝑟𝑗𝑙+1 )
Le gocce 𝑖 e 𝑘 sono identificate come la stessa su layer diversi se:
𝑙
𝑑𝑖,𝑘
< 1 → si sovrappongo
𝑙
𝑙
𝑑𝑖,𝑘
= min 𝑑𝑖,𝑗
→ la zona di sovrapposizione è massima
𝑗
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
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FASI DELL’ANALISI:
Mappa delle gocce di lipidi in una cellula
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝒈 𝒓 /𝒈 𝒅
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
La funzione di distribuzione radiale
𝑔 𝑟 , in un sistema di particelle,
descrive come varia la densità in
funzione della distanza da una
particella presa come riferimento
𝑔2𝐷 𝑟 + 𝑑𝑟 2 =
1
1
⋅
𝜋[ 𝑟+𝑑𝑟 2 −𝑟 2 ] 𝑁𝜌
𝑖 𝑛𝑖 (𝑟, 𝑟
+ 𝑑𝑟)
𝑔3𝐷 𝑟 + 𝑑𝑟 2 =
1
1
⋅
4 𝜋[ 𝑟+𝑑𝑟 3 −𝑟 3 ] 𝑁𝜌
3
𝑖 𝑛𝑖
𝑟, 𝑟 + 𝑑𝑟
𝑔 𝑟
→
con 𝑟 distanza fra i
centri delle particelle
𝑔 𝑑
→
con 𝑑 distanza fra i
bordi delle particelle
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FASI DELL’ANALISI:
Nel caso di volume finito
possiamo:
1. Acquisizione
•
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
•
tenere conto del volume
effettivo in cui cerchiamo
vicini per le particelle al
bordo;
introdurre PBC (minimum
image convention)
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
Ciò non è applicabile al caso
delle cellule dove il bordo non
è ben definito
4. Applicazione a
immagini acquisite
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing
𝑔 𝑟 per particelle puntiformi uniformemente distribuite:
• con PBC
→
costante al valore 1
• senza PBC → decadimento anomalo, previsto analiticamente
tenendo presente l’area effettiva dove vengono cercati vicini per
le particelle al bordo
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
2𝑟 ⋅ 𝑙𝑥 − 2𝑟 ⋅ 1 − 1 𝜋 + 𝑙𝑦 − 2𝑟 ⋅ 𝑙𝑥 − 2𝑟 𝜋 +
𝑦
cos−1 ( 𝑥 𝑟) cos −1 ( 𝑟)
+4 ⋅
1−
−
𝑑𝑥 𝑑𝑦 +
𝜋
𝜋
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
2𝐷
𝑔𝑢𝑛𝑖𝑓
𝑥<𝑟
𝑦<𝑟
𝑥 2 +𝑦2 >𝑟 2
1
𝑟 =
⋅
𝑙𝑥 ⋅ 𝑙𝑦
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
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vibrazionale
+4 ⋅
𝑥<𝑟
𝑦<𝑟
𝑥 2 +𝑦2 <𝑟 2
𝑦
3 cos−1 ( 𝑥 𝑟) cos −1 ( 𝑟)
−
−
𝑑𝑥 𝑑𝑦
4
2𝜋
2𝜋
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
Per particelle che evolvono in un certo volume potremo
correggere la 𝑔(𝑟) ottenuta senza PBC detta 𝑔𝑟𝑎𝑤 𝑟 , calcolando
la 𝑔𝑢𝑛𝑖𝑓 (𝑟) ossia la 𝑔(𝑟) per particelle puntiformi disposte
uniformemente nello stesso volume:
𝑔𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑡𝑒𝑑 𝑟 = 𝑔𝑟𝑎𝑤 𝑟 − 𝑔𝑢𝑛𝑖𝑓 𝑟 + 1
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
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epatociti determinato mediante imaging
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
Nel caso delle cellule resta il problema di definire un’area effettiva,
ossia una zona dove la distanza fra le gocce è paragonabile alle
dimensioni stesse di queste ultime; lo facciamo dividendo
l’immagine in rettangolini e stabilendo una densità di soglia
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝒈(𝒓) / 𝒈(𝒅)
4. Applicazione a
immagini acquisite
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FASI DELL’ANALISI:
𝒈(𝒓) calcolata in 2D
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
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FASI DELL’ANALISI:
𝒈(𝒅) calcolata in 2D
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
Analisi statistica di accumulo lipidico in
epatociti determinato mediante imaging
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Pagina 16
FASI DELL’ANALISI:
𝒈(𝒓) calcolata in 3D
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
Analisi statistica di accumulo lipidico in
epatociti determinato mediante imaging
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FASI DELL’ANALISI:
𝒈(𝒅) calcolata in 3D
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
Analisi statistica di accumulo lipidico in
epatociti determinato mediante imaging
vibrazionale
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FASI DELL’ANALISI:
Cellula trattata con acido oleico e entinostat
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
Analisi statistica di accumulo lipidico in
epatociti determinato mediante imaging
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FASI DELL’ANALISI:
Cellula trattata con acido oleico
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di
distribuzione radiale
• 𝑔 𝑟 /𝑔 𝑑
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione 𝑔(𝑟) / 𝑔(𝑑)
4. Applicazione a
immagini acquisite
Analisi statistica di accumulo lipidico in
epatociti determinato mediante imaging
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Prospettive future
La funzione di distribuzione radiale ha delle caratteristiche peculiari che
rispecchiano aspetti osservabili qualitativamente nelle immagini come:
• presenza di picchi → ordine nella disposizione delle gocce
• posizione dei picchi → disposizione più o meno compatta delle gocce
• larghezza dei picchi → diversità nelle dimensioni delle gocce
L’idea, a lungo termine, è quella di costruire una banca dati con tali
informazioni e confrontare la risposta delle cellule a diversi trattamenti, al
fine di avere più chiaro il loro effetto
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