PROTEINA PRECURSORE β – AMILOIDE (APP):
UNA VISIONE D’INSIEME
Research article
Secreted APP regulates the function of full-length APP in
neurite outgrowth through interaction with integrin beta1
Tracy L Young-Pearse, Allen C Chen, Rui Chang, Cesar Marquez and Dennis J. Selkoe
Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School,
Boston, MA 02115, USA
Published: 23 June 2008
Neural Development 2008,
VITO MARIA BUONOMENNA
FEDERICA SARACENO
•STRUTTURA E FUNZIONI APP
•ANALISI E DATI SPERIMENTALI
•ALTERAZIONI PATOLOGICHE
STRUTTURA &
FUNZIONI
La proteina precursore
dell’amiloide (APP)
È una glicoproteina di
membrana di tipo I
Codificata da un gene
localizzato sul braccio
lungo del cromosoma 21
Identificata nel 1987
APP è espressa in tre isoforme costituite rispettivamente da
695, 751 e 770 amminoacidi.
È localizzata sulla membrana plasmatica dei dendriti, del
corpo e degli assoni sia di cellule neuronali che di quelle gliali
Traffico intracellulare di APP
•La forma matura, dalle
membrane del golgi ,
raggiunge la membrana
celullulare (step 1)
•Dalla membrana plasmatica
viene internalizzata con
vescicole endocitiche (step 2)
•Nell’endosoma viene o
reciclata e ripresentata in
membrana o degradata
tramite enzimi idrolitici
(step 3)
L’APP svolge alcune
funzioni come proteina
intatta e ne svolge altre
quando è ridotta in
frammenti .
Il clivaggio della proteina
avviene attraverso tre
specifiche proteasi , su
determinate sequenze sia
sul dominio
intracitoplasmatico che
extracellulare
L’enzima maggiormente coinvolto fisiologicamente
nella processazione di APP è l’ α-secretasi
appartenente alla famiglia ADAM ( A Disintegrin
and Metallopeptidase).
Tale famiglia di enzimi tagliano specifiche
sequenze dell’intera glicoproteina portando al
rilascio di un frammento extracellulare che prende
Il nome di frammento α della proteina amiloidea
(APPα)
Le α-secretasi non sono gli unici enzimi che possono
mediare il clivaggio di APP , anche le β-secretasi e le
γ-secretasi hanno la medesima funzione.
Il taglio effettuato da quest’ultimo enzima porta alla
formazione di frammenti amiloidogenici coinvolti
nell’eziogenesi di alcune patologie tra cui le sindromi
di Alzheimer ( AD)
APP e APPα hanno un ruolo centrale nel
controllo della crescita neuronale.
Numerosi esperimenti dimostrano che la
lunghezza del neurite dipende da un fine
equilibrio tra APP ed il suo frammento.
La proteina integra inibisce l’eccessiva crescita
dell’assone mentre APPs α si oppone all’attività
di APP
La proteina precursore dell’amiloide puà regolare la crescita assonale tramite
l’integrazione con un’integrina di membrana .
L’Itg 1 attiva una
cascata di segnali
intracellulari che
aumentano la
crescita del
neurite .
La funzione di APP è quella di inibire l’attività
dell’integrina tramite un’ interazione omotipica attraverso
uno specifico dominio di legame (NPXY).
APPs-α può competere con APP impedendo il legame con
l’integrina β1 e quindi favorendo la crescita dell’assone
L’interazione tra APP
e l’integrina β1 è
mediata da una
proteina adattarice
Fe65 che trasporta il
dominio AICD nel
nucleo, il quale regola
la trascrizione genica
di molecole per il
citoscheletro, con
implicazione nella
crescita assonale
Fe
65
ANALISI &
DATI SPERIMENTALI
Cellule corticali di topi knock out per APP presentano
assoni più lunghi
small harpin RNA (shRNA) sono
sequenze di RNA che,
curvandosi, formano una
struttura che ricorda una forcina.
Vengono solitamente utilizzati
per il silenziamento
dell'espressione genica attraverso
l'attivazione della RNA
interference.
Nell’immagine
Nell’immagine EF èè mostrata
mostrata l’elettroporazione
l’elettroporazione in
in
vivo
siatrasfettati
con GFP che
vivodi
di neuroni
neuroni trasfettati
di controllo
concon
GFP
shRNA.
Per dimostrare il legame tra APP e Itg β1 è
stato utilizzata l’immunoprecipitazione .
•Formazione di fibrille di amiloide
•Apoptosi e stress ossidativo
•Processi infiammatori
La sintesi e l’accumulo di frammenti del peptide Aβ nella
matrice extracellulare in specifiche aree encefaliche porta alla
formazione delle cosiddette placche senili: formazioni di fibrille
amiloidee costituite da aggregati del peptide Aβ disposti in
foglietti pieghettati con disposizione antiparallela
Fibrille di amiloide sono state osservate anche disposte intorno ai
capillari cerebrali disponendosi in una caratteristica struttura
granulare.
Placche neurofibrillari
Placche senili disposte intorno a
capillari. (Fissate con blu di toluidina)
Placche senili
Il core delle placche senili risulta essere estremamente
resistente a proteolisi di potenti caotropici. In queste
strutture sono presenti frammenti Aβ, che costituiscono
circa il 50-60% di questi ammassi fibrillari; sono presenti
inoltre glicoproteine e glicolipi che rendono ulteriormente
insolubili queste strutture.
Oltre alla stabilità intrinseca di Aβ N-42, l’accumulo di
dimeri e tetrameri incorporati essi stessi in filamenti di β
amiloide aumenta la resistenza alla degradazione
proteolitica. Inoltre la presenza di modifiche posttrasduzionali (isomerizzazione, ciclizzazione ed
ossidazione) contribuisce all’aumento dell’insolubilità.
.
Gli enzimi coinvolti nel taglio proteolitico della proteina di
membrana APP sono:
• α-secretasi
•β-secretasi
•γ-secretasi
La β-Secretasi, detta anche BACE1 (β-site of APP cleaving
enzyme) o memapsina-2, è una aspartato proteasi acida
importante nella patogenesi dell’AD. É una proteina
trasmembrana codificata dal h11q23.3 sul cromosoma 11.
BACE viene codificata anche da un secondo gene presente
sul cromosoma 21 (BACE2) implicato probabilmente nella
sindrome di Down. BACE1 è una proteina di membrana
espressa sia in cellule neuronali che gliali. È localizzata
prevalentemente nell’E.R. e nel trans-Golgi, come pro-enzima.
BACE
La sua attivazione avviene
mediante fosforilazione e
attraverso il traffico intracellulare
raggiunge la membrana
plasmatica dove esplica la
funzione maggiormente nota,
il taglio proteolitico di APP su
specifici amminoacidi (Asp+1 –
Glu+11) formando il frammento
solubile β-42 ed il C-99
È stato dimostrato come l’enzima maggiormente coinvolto nella produzione
del peptide β-42 sia proprio BACE1. BACE 1 sicuramente presenta altri target
oltre APP, ma l’individuazione dei ruoli fisiologici di BACE1 è ancora in certa.
Sicuramente in soggetti affetti da AD l’espressione di questo enzima aumenta
notevolmente. Un ipotesi plausibile di tale espressione potrebbe consistere in:
Processi infiammatori
cronici
Attività di base
di BACE1
Quantità minime
di β39-42
Aumento
dell’espressione
Placche senili &
fibrille di amiloide
Mancata
clearence
Accumulo β42
Γ-secretasi è un complesso proteolitico costituito da quattro proteine
di membrana (Presenil, Nicastrin, APH-1, PEN2 ) la prima sembra
presentare attività enzimatica. Se per BACE1 l’attività enzimatica ed il
suo contributo nella patogenesi di placche di amiloide non è ancora
del tutto chiara , nonostante l’enorme interesse che essa suscita, a
maggior ragione l’attività ed i pathway del complesso di γ-secretasi
sono ancora “oscuri”. Sicuramente essa agisce secondariamente agli
altri due enzimi precedenti ed è coinvolta nel taglio del frammento
C99, rilasciando un breve frammento membranario ed un frammento
intracellulare, cosiddetto NICD
(Notch IntraCellular Domain ).
Tale frammento, attraverso il pathway
di segnalazione di Notch, attiva
programmi di trascrizione genica.
Mutazioni a caricodel gene della
presenilin 1 sembrano causare
forme ereditarie di Sindrome
di Alzheimer (FAD)
Amiloide e morte cellulare
Aβ42 (12.5 μg/ml), 3.91%
apoptotiche; 39.3 necrotiche
Cellule IMR32 senza trattamento
Cellule in coltura con frammenti Aβ41-42
rilasciano 4-hydroxynonenal (HNE),
Cellule in coltura con frammenti Aβ41-42
rilasciano h202
Tatsuo Yamada et al. Experimental Neurology 196 (2005)
(50 μg/ml), apoptotic,
necrotic, 55.32%, 26.75%,
Elena Tamagno et al.
Free Radical Biology & Medicine, Vol. 35, 2003
Quali segnali sono coinvolti?
H2O2 HNE etc
A β 40-42
Fas
L Fas
FADD
SAPK
JNK3
DISC
Caspase 8
c - Jun
Fos
AP1
APOPTOSI
L Fas
•Il peptide Aβ42 , citochine pro-infiammatorie e ROS, ad alte
concentrazione, possono indurre stress ossidativo e attraverso
le SAPKs (Stress Activated Protein Kinase, attivare il pathway di
JNK3/c-Jun. JNK3/c-Jun determina il reclutamento di regolatori
della trascrizione genica che inducono un aumento
dell’espressione di Fas Ligand. Tale proteina legandosi al
recettore Fas attiva la via “estrinseca” di morte programmata
formando il complesso DISC (death-inducing signaling
complex) che attiva la caspasi 8 e l’inizio della cascata pro
apoptotica.1
1Amyloid
Induces Neuronal Apoptosis Via a Mechanism that Involves the c-Jun N-Terminal Kinase Pathway and the
Induction of Fas Ligand. Yoshiyuki Morishima et al. The Journal of Neuroscience, October 1, 2001, 21(19):7551–7560
PROCESSI INFIAMMATORI
Le patologie neurodegenerative sono associate ad una risposta immunitaria
innata consistente nell’attivazione delle cellule della microglia.
Il peptide Aβ può interagire direttamente con i recettori delle cellule della
microglia, tra cui RAGE (Receptor for Avanded Glycation End product), scavenger
receptor CD36 .
Il peptide Aβ può interagire anche con componenti del complemento.
L’attivazione della microglia comporta il rilascio di fattori solubili , induzione
della chemotassi, della clearence e della degradazione dei frammenti di Aβ
1) Reclutamento
microglia
2) Attivazione
fagocitosi
3) Rilascio
citochine proinfiammatorie
4) Degradazione
β- amiloide
Studi su topi transgenici per PS1-APP hanno dimostrato come l’aumento della vita media
delle cellulle della microglia porti ad una progressiva riduzione dell’espressione di
scavenger receptor, CD 36, RAGE ed enzimi di degradazione. Altresì rimane inalterata
l’espressione di molecole pro – infiammatorie
… Inoltre PGE2 stimola la produzione del peptide Aβ.
L’interazione tra PGE2 ed i suoi recettori EP2 ed EP4 comporta l’
internalizzazione di PS-1 e la co-localizzazione con gli stessi
recettori , che portano ad un aumento di PKA e cAMP che
sembrano agire sulla stessa subunità catalitica della γ-secretasi
aumentando la produzione del peptide Aβ e indirettamente
l’espressione di geni coinvolti nella sua produzione.
Cellule della microglia e asctrociti, In
risposta alle placche di amiloide,
producono numerose componenti
della cascata del complemento.
L’attivazione del complemento
sembra avere un ruolo protettivo nei
confronti della β–amiloide.
In modelli di topo APP transgenici è
stata osservata la sovraespressione
di sCrry che inibisce la formazione
delle C3 convertasi.
sCrry è una proteina regolatrice del
complemento roditori specifica.
Nell’uomo presenta due proteine
omologhe : La proteina cofatorriale
di membrana (MCP) ed il fattore
accelerante il degrado (DAF)
In conclusione…
La sintesi di frammenti di Aβ sembra essere un evento
fisiologico coinvolto nei fenomeni di aging. L’accumulo di tali
frammenti nella matrice extracellulare ed una progressiva
diminuzione dell’attività della microglia porta alla formazione
di placche di amiloide e placche senili, che per le loro
caratteristiche chimico – fisiche risultano essere insolubili,
difficili da fagocitare e tossiche per le cellule neuronali. In
questo contesto sembra avere un ruolo chiave la microglia, in
quanto generalmente è responsabile della clearence di
frammenti di Aβ. Quando l’ attività viene alterata, essa induce,
attraverso il rilascio di molecole pro – infiammatorie, un
processo infiammatorio cronico che aggrava e accelera il
processo neurodegenerativo
GRAZIE PER
L’ATTENZIONE
References
Regulation of Amyloid-Protein Precursor by Phosphorylation and Protein Interactions, Suzuki et al. the journal of biological chemistry. 2008
Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through
interaction with integrin beta1-Selkoe D. et al. Neuronal Development 2008,
The -Secretase Enzyme BACE in Health and Alzheimer’s Disease: Regulation, Cell
Biology, Function, and Therapeutic Potential- Vassar R. et al. - The Journal of Neuroscience,
2009
Toward Structural Elucidation of the g-Secretase Complex - Selkoe D. et al. Structure. 2009
Multiple signaling events in amyloid -induced, oxidative stress-dependent neuronal
apoptosis - Tamagno E. et al. Free Radical Biology & Medicine. 2003
-Amyloid Induces Neuronal Apoptosis Via a Mechanism that
Involves the c-Jun N-Terminal Kinase Pathway and the Induction of Fas Ligand –
Morishima et al. The Journal of Neuroscience, 2001,
The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) as modulator
of gene expression, apoptosis, and cytoskeletal dynamics—Relevance
for Alzheimer’s disease - Muller T. et al. Progress in Neurobiology, 2008