Cinetica della risposta delle cellule T e B ad un’infezione acuta
Cinetica della risposta delle cellule T e B ad un’infezione acuta
L’Immunità Adattativa non sempre viene attivata
Le CELLULE
NATURAL
KILLER:
cellule con licenza di uccidere
Le cellule NK si trovano:
• Nel sangue (15-20% linfociti)
• Nella milza
• Nei linfonodi (uomo: circa 5% dei linfociti)
• Nei tessuti periferici
(fegato, cavità peritoneale, epiteli?)
Una volta attivate le cellule NK:
• Hanno attività citolitica diretta (perforina)
• Producono citochine (IFNg, TNFa, TGFb)
• Producono chemochine (MIP-1b)
Regolazione dell’attività delle cellule NK:
le “split responses”
Le cellule NK rispondono diversamente a diversi stimoli:
l’induzione di citochine e la risposta citotossica sono
controllate da vie differenti
Linee tumorali
Risposta anti-virale
NK Cell’S
Il “bacio della morte”:
I granuli litci sono trasportati alla immunosinapsi
grazie ad una riorganizzazione dei microtubuli
L’ attività citolitica diretta delle cellule NK è
mediata da perforina
La perforina forma pori di 15-16 nm alterando la
membrana plasmatica delle cellule target
Alla perforina si aggiunge l’azione dei:
• Granzyme A (tagli in ssDNA)
• Granzyme B (via delle caspasi)
Le cellule NK sono protette grazie:
1. Al rilascio dei diversi mediatori citotossici
ESCLUSIVAMENTE a livello della sinapsi
2. Alla presenza di una forma legata alla
membrana della Catepsina B (che è in grado di
tagliare la perforina)
Come si attivano le
cellule NK?
Le cellule NK sono linfociti dell’immunità innata
che esprimono:
• Recettori inibitori
• Recettori attivatori
I Recettori INIBITORI:
Nel 1986 Klas Karre propone la teoria del MISSING SELF
Secondo questa teoria le cellule NK hanno dei recettori inibitori
che riconoscono molecole MHC di classe I e che inibiscono
l’attività citolitica delle cellule NK:
Esperimenti di citotossicità su RMA T-cell linfoma e RMA-S.
Crescita in animali
singenici o rigetto
I recettori inibitori sono altamente polimorfici e riconoscono
determinanti polimorfici sulle molecole MHC di classe I
Esistono tre classi principali di recettori inibitori:
• KIR (Killer-cell Ig-like Receptor), NK umane
• Ly-49 (lectin-like receptor), NK murine
• CD94/NKG2A (eterodimero), NK sia umane che murine
Recentemente è stato individuato una nuova classe di
recettori inibitori polimorfici:
NKR-P1B and NKR-P1D
(NKR-P1 family, lectin-like type 2 tm receptors)
• Riconoscono Ocil (Clr-b)
• Ocil stesso è un membro della famiglia delle lectin-like type
2 tm proteins
• Ocil è ampiamente espresso su cellule normali ma DOWNREGOLATO in cells tumorali
Qa-1b (murino) e
HLA-E (umano):
MHC atipici, basso
polimorfismo,
sequenze leader
I recettori inibitori contengono dei domini ITIM
(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory) capaci di reclutare
le fosfatasi SHP-1 e SHP-2.
ZAP-70
Blocco trasduzione
I Recettori ATTIVATORI:
La teoria del MISSING SELF non sempre è in grado predire
correttamente l’attivazione delle cellule NK:
cellule che esprimono livelli normali di MHC I possono essere
uccise dalle cellule NK, in questo processo sono fondamentali
i recettori attivatori delle cellule NK.
Le cellule NK non utilizzano un unico recettore attivatorio
multipotente, bensì una serie di recettori diversi
FcgRIIIa
(IgG1,3)
ADCC
NCR
MHC
classe I
I recettori attivatori mancano di attività intrinseca e si
associano a diverse proteine adattatrici:
CD28 in T cells
ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activating domain
pYINM: PI3K binding motif
Il recettore attivatorio NKG2D:
Cellule che esprimono normali livelli di MHC classe I, MA che
esprimono ligandi per NKG2D sono lisate da cells NK
I diversi ligandi di NKG2D:
Humans:
• MIC -A-B:
MHC I chain related -A e -B
(virus/stress)
• ULBP:
UL-16 binding protein (virus)
Mice:
• Rae1:
Retinoic early transcript 1
• Mult1:
Mouse UL16-bind like
transcript (2002)
• H60: minor his.complx
TLRs e NKG2D:
E’ possibile che i TLR modulino l’espressone di NKG2D o che i due
recettori cooperino nell’inviare segnali attivatori
Sviluppo e selezione delle cellule NK:
Le cellule NK si sviluppano nel midollo osseo.
Meccanismo di selezione:
• Le cellule NK esprimono più recettori inibitori che
funzionano in modo indipendente
• Diverse cellule NK esprimono diversi recettori inibitori
• L’aplotipo dell’MHC di classe I influenza il repertorio di
cellule NK: le cellule NK hanno recettori inibitori solo per
l’MHC cl I presente nell’ambiente di sviluppo
Missing Self!!!
Fenomeno della Hybrid resistance:
Le cellule NK del topo F1 rigettano le cellule ematopoietiche dei
genitori
Padre
MHC classe I aplotipo x,y
Madre
MHC classe I aplotipo z,k
NK
NK
NK Cells selezionate per MHC
classe I x,y
NK Cells selezionate per MHC
classe I z,k
NK
Figlio
MHC classe I aplotipo x,z
NK Cells selezionate per MHC
classe I x,z
Le cells NK del figlio non RICONOSCONO y e k con recettori
inibitori, pertanto vedranno “down regolazione” delle molecole MHC
di classe I sia sulle cellule paterne (mancano di z) che sulle cellule
materne (mancano di x)
Espressione di recettori durante lo sviluppo delle cellule NK:
Le cellule NK subiscono un processo di selezione.
• Ruolo positivo dei recettori inibitori Ly49
• Aumentata proliferazione delle cellule NK se esprimono un
recettore inibitorio per una molecola MHC self (selezione
positiva)
• I recettori utilizzati in periferia per l’inibizione vengono usati
a livello midollare per trovare antigeni self che inducano la
maturazione funzionale delle cellule NK
• Cellule NK che non riconoscono antigeni self (=non hanno
recettori inibitori Ly49 per molecole MHC self) non possono
svolgere la propria attività (citotossica/IFNgamma) in periferia
Risposte immunitarie delle cellule NK:
• ATTIVITA’ ANTI-TUMORALE
L’eliminazione delle cellule NK in vivo provoca un aumento
della formazione di tumori.
Linee tumorali esprimenti i ligandi per NKG2D (MIC-A/-B,
ULBP, RAE-1, Mult) sono sensibili alla lisi da parte delle cellule
NK indipendentemente dall’espressione delle molecole MHC di
classe I.
MICA MICB espressi
anche da tumori primari
di origine epiteliale.
B16-BL6 melanoma: NO
ligandi per NKG2D--> è
una delle linne tumorali
maggiormente
tumorogenica e non
immunogenica
• ATTIVITA’ ANTI-BATTERICA:
La forte produzione di interferone g da parte delle cellule
NK può:
• indurre l’attivazione di macrofagi
• può favorire la polarizzazione delle cellule T verso una
risposta di tipo Th-1
• può portare alla produzione della iNOS con rilascio di NO
•ATTIVITA’ ANTI-VIRALE:
Ruolo fondamentale nelle risposte contro gli Herpesviruses,
in particolare HCMV e MCMV
CMV:
• alteraz TAP e espressione MHC
• UL18: simile a MHC cl I
• UL40: favorisce up regolazione HLA-E
• UL16: lega ULBP1,2 MICB
Altri virus:
virus dell’influenza (NKp46)
EBV (CD244, se manca SAP--> morte del paziente)
Se le cellule NK hanno un ruolo nell’immunità
innata, quali sono i meccanismi precoci che sono
coinvolti nel priming di queste cellule?
NK cells
Recettori inibitori specifici per
molecole MHC di classe I:
• FcgRIIIa (CD16)
•Recettori attivatori: NKG2D,
NKp30, NKG2C
Activation
NKG2A, KIR, Ly49
?
Inhibition
Cytokines:
IL-15, IL-12, IFNs I,
IL-2
Inhibition
Activation
Relazioni fra cellule NK e Cellule Dendritiche
a)
Le cellule NK e le DC vengono
richiamate da iDC residenti,
macrofagi, cellule endoteliali e
neutrofili
b)
Le cellule NK fanno rapidamente
citolisi (attivata da IFN tipo I) e
questa azione viene amplificata dal
contatto con iDC che producono
IFN type I
c)
In seguito al contatto col patogeno ,
le DC producono numerose
citochine fra cui IL-2, IL-12, IL-15
d)
Le cellule NK proliferano
e)
Le cellule NK diventano pienamente
attivate, producono IFNg e hanno
attivita citotossica anche nei
confronti delle DC
f) Le cellule NK possono anche indurre la maturazione delle DC via TNFa
g) Le mDC migrano ai linfociti per attivare la risposta immunitaria adattativa
Le cellule NK inducono morte o maturazione (TNFa) delle
cellule dendritiche???
Dipende dal rapporto NK/DC
Ruolo dell’IL-2 nell’attivazione delle cellule NK:
L’incubazione delle cellule NK in vitro con rIL-2 causa una
loro forte attivazione e permette loro di uccidere cellule prima
resistenti.
L’ hrIL-2 è utilizzata come farmaco per l’immunoterapia di
tumori in pazienti con numerose metastasi.
La sua somministrazione in vivo provoca una “superattivazione” delle cellule NK che diventano LAK (linphokineactivated killer), che possono infiltrare i siti tumorali.
A questo processo è inoltre associata una grossa produzione di
interferone g.
L’IL-2 prodotta nelle fasi iniziali della risposta immunitaria
dalle DC può avere un ruolo fondamentale nel processo di
attivazione delle cellule NK?
SI’!
Attivazione di DC con stimolo batterico:
Le DC producono precocemente IL-2
IN VITRO:
+
Bacteria
Immature BMDC (E.Coli DH5a)
NK cells
18h
ELISA for IFNg production by NK cells
L’IL-2 in vitro è necessaria per indurre l’attivazione delle
cellule NK in termini di produzione di interferone g
1200
bacteria + NK
bacteria + NK + anti-IL-2 Ab
bacteria + NK + isotype-ctrl Ab
bacteria + NK + rIL-2
NK
bacteria
alone
1000
pg/ml
800
600
400
200
0
wtBMDC
IL-2-/-
NK
L’IL-2 non è sufficiente ad indurre la produzione di
interferone g
1200
1000
E.Coli + NK
NK + IL-2
E.Coli + NK + IL-2
NK
pg/ml
800
600
400
200
0
wtBMDC
wtBMDC in transwell
IN VIVO:
L’IL-2 è necessaria per indurre l’attivazione delle cellule NK in
termini di produzione di interferone g.
Bacteria
(E.Coli DH5a)
4h
Intracellular staining for IFNg production by NK cells
30
20
p<0.05
IL-2 -/-
Wild type
isotype
not treated
isotype +
E.Coli
anti-IL-2
not treated
anti-IL-2 +
E.Coli
not treated
E.Coli
0
not treated
10
E.Coli
% IFNg high
40
Lung metastasis
counting two weeks
later
60
40
p<0.05
0
B16
Activated
wtBMDC
20
Activated
IL-2-/-BMDC
No. lung metastasis
RAG-/-
B16 melanoma cells
metastatize in the lungs
Metastasis growth can be
blocked by NK cell-derived
IFNg
Ruolo IFNg prodotto dalle cellule NK nelle successive risposte
dell’immunità adattativa?
E’ stato recentemente visto che:
• Cellule NK attivate da cellule che esprimono bassi livelli di MHC
classe I sono in grado (grazie alla produzione di IFN gamma) di
indurre la produzione di IL-12 da parte delle DC che sono quindi in
grado di attivare CTL
• Cellule NK sono in grado di indurre la differenziazione delle cellule
dendritiche a DC1
in seguito ad attivazione con cellule tumorali e IFN type I
CELLULE NK-T
Le cellule NK-T sono una sottopopolazione dei linfociti T
esprimente:
• Repertorio ab TCR ristretto
• Recettori delle cellule NK: NK1.1, DX5, Ly-49
• Markers delle cellule T attivate/memrry:
CD44high, CD69+, CD62L-
Le cellule NK-T sono una popolazione disomogenea:
Le cellule NK-T umane esprimono la catena Va24
Le cellule NK-T dipendono per lo sviluppo da CD1-d
Le cellule NK-T rappresentano il 20-30% dei linfociti epatici
Le cellule NK-T ricevono segnali attivatori attraverso il TCR
e segnali inibitori attraverso Ly-49
Il TCR riconosce peptidi presentati dalla molecola MHC I
non convenzionale CD1d: i ligandi “naturali” delle cellule
NK-T non sono noti (micobatterio tubercolosi?), aGalCer è
un glicolipide in grado di attivare fortemente le cellule NK-T
Una volta attivate dal legame del TCR a CD1d-aGalCer
le cellule NK-T:
• Hanno attività citolitica diretta o indiretta tramite
l’attivazione delle cellule NK
• Producono rapidamente, entro poche ore
dall’attivazione, grosse quantità di IL-4 e IFNg
Sviluppo e selezione delle cellule NK-T:
T prima di NK
• Le cellule NK-T si sviluppano
nel TIMO (CD1d!!!)
• Le cellule NK-T sono
selezionate positivamente da
timociti corticali DP che
esprimono CD1d
• Caratteri cellule NK-T:
selezione da timociti DP? Alta
avidità di legame (memory)?
• Possibile autoreattività
periferica controllata da
recettori inibitori cellule NK (Ly49)
Risposte immunitarie delle cellule NK-T:
• Resistenza ai tumori:
L’iniezione di aGalCer (meglio su DC) può essere
importante nella prevenzione della crescita tumorale e
metastatica, attraverso:
• attività citotossica diretta
• produzione di IFNg
• attivazione delle cellule NK
• Autoimmunità:
Ruolo della prevenzione del diabete in topi NOD:
• Riduzione incidenza del diabete in seguito a
trasferimento di cellule NK-T;
• Aumento incidenza in topi NOD CD1d-/Meccanismo: aumento citochine Th-2?
• Attività contro agenti infettivi:
Le cellule NK-T partecipano alla difesa contro batteri, virus,
parassiti, in alcuni casi in assenza di attivazione con aGalCer: in
questi casi la produzione di IFNg è fondamentale
• Indirizzamento della risposta adattativa?
La capacità di produrre sia IFNg che IL-4 rende le cellule
NK-T dei potenziali regolatori della successiva risposta
adattativa
NK-T immature--> IL-4
NK-T mature--> IFNg
PERCHE’ L’IMMUNITA’ INNATA?
• I vaccini a DNA sono meno costosi, possono essere preparati più
facilmente e possono indurre una risposta protettiva CD8+ ma per essere
immunogenici devono provocare l’attivazione dell’immunità innata:
• Aggiunta di motivi CpG non metilati che attivano DC, Macrofagi e
cellule NK
• Aggiunta della sequenza del fattore del complemento C3d
Costimolazione
Formazione centri
germinali e
memory B cells
• Terapia anti-leucemica:
Trapianto di midollo aploidentico (identico solo per un aplotipo
dell’MHC classe I e completamente diverso per l’altro).
Alcune cellule NK esprimeranno KIR che non riconoscono l’MHC del
ricevente e avranno una forte alloreattività contro le cellule
ematopoietiche (fra cui quelle tumorali) del ricevente stesso.
No sufficienti
ligandi per
recettori attivatori
Terapia anti-leucemica:
I target delle cellule NK oltre ad essere le cellule T sembrano essere le
DCs del ricevente che sono le responsbili principali del GvHD
Oggi questa terapia anti-leucemica è stata migliorata eseguendo
trapianti di midollo aploidentici depletati di cellule T e arricchiti in
cellule NK.
Il numero di cellule NK trasferite sembra essere fondamentale per
determinare GVL rispetto a GvHD
• Autoimmunità:
Comunemente in autoreattività interessate cellule T e B (Sclerosi
Multipla, Artrite Reumatoide, diabete mellito,…)
Spesso patologie autoreattive scatenate da infezioni (modelli animali)
che possono fare molecular mimicry, dare danni bystender o rivelare
nuovi epitopi
Cells immunità innata possono
influenzare linfociti immunità
adattativa favorendo/bloccando
reazioni autoimmunitarie:
EAE (encefalomielite
autoimmune sperimentale):
eliminazione NK aumenta
patologia
Diabete indotto da
ciclofosfamide:eliminazione NK
riduzione sviluppo patologia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence, Ganz et al, Curent Op. in
Immunol. 1999
Innate immunity, Janeway Jr et al., Curent Op. in Immunol. 1999
Membrane receptors for soluble defense collagens, Tenner, Curent Op. in Immunol. 1999
The neutrophil: function and regulation in innate and humoral immunity, Pillinger et al.,
Clinical Immunology 2001
Mast cells as sentinels of innate immunity, Lantz et al., Curent Op. in Immunol 1999
Roles of mast cells and basophils in innate and acquired immunity, Galli et al., Curent
Op. in Immunol. 2000
Interpretation of complexity of innate immune responses by functional genomics,
Granucci et al., Nature Reviews Immunology 2002
Toll like receptors and innate immunity, Medzhitov, Nature Reviews Immunology 2001
Neutriphils: molecules, functions, and pathophysiological aspects, Witko-Sarsat, 2000
Eosinophils, allergy and parasites, Dombrowicz et al., 2001
Studies of multifaceted mast cell response to bacteria, McLachlan et al., 2001
The cell biology of macrophage activation, Adams et al, 1984
Nitric oxide and macrophage function, MacMicking et al., 1997
Th human basophil: a new appreciation of its role in immune responses, Falcone et al.,
2000
Natural killer cells, viruses and cancer, Lanier et al., Nature Reviews Immunology, 2001
NK cells and NKT cells in innate defense against viral infections, Brossay et al., Curent
Op. in Immunol. 2001
Natural killer cell tolerance in mice with expression of major histocompatibility complex
class I transgene, Hoglund et al., 1997
18. Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines,
Salazar-Mather, Annu. Rev. Immunol. 1999
19. Natural killer cells and dendritic cells: rendezvous in abused tissues, Nature Reviews
Immunology 2002
20. NK cells secrete high levels of IFN-gamma in response to in vivo administration of IL-2,
Hirsch et al., Eur.J.Immunol. 2001
21. The unconventional lifestyle of NKT cells, Gapin et al., Nature Reviews Immunology
2002
22. T before NK, MacDonald, Science 2002
23. Prolonged IFN-gamm-producing NKT response induced with alpha-galactosylceramideloaded DCs, Steinman et al., Nature Immunology, 2002
24. Innate immunity-beginning to fulfill its promise?, Fearon, Nature Immunology 2000
25. Innate immunity and autoimmunity:from self protection to self destruction, Shi et al.,
2001
26. Flexibility of mouse classical and plasmacytoid-derived DC in directing Th type 1 or 2
cell development:…, Boonstra et al., 2003
27. The ability of murine DC subsets to direct T helper cell differentiation is dependent on
microbial signals, Manickasingham et al., 2003
28. Natural killer cells activated by MHC class I low targets prime DC to induce protective
CD8 T cell responses, Mocikat et al., 2003
29. Dendritic cells mediate NK cell help for Th1 and Th2 CTL responses: two-signal
requirement for the induction of NJK cell function, Mailard et al., 2003
30. Roles of the immunoreceptor NKGD2 and its ligands,Raulet, 2003