Attività elettrica dei
neuroni
Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti
Voltage clamp
Col metodo del “voltage clamp” la membrana viene portata ad un potenziale fisso
prestabilito e si registrano le correnti necessarie a mantenerla “bloccata” (”clampata”) a
quel potenziale.
Un
amplificatore
differenziale (A) inietta
nella cellula una corrente
Im, proporzionale alla
differenza
tra
un
potenziale di comando
(applicato
all’ingresso
“+”) ed il potenziale di
membrana Vm (applicato
all’ingresso “-”) .
Due risultati utili:
a) Vm viene quasi portato a coincidere col potenziale di comando;
b) la variazione di Vm è praticamente istantanea, cosicché la corrente capacitiva
(Ic=C dV/dt), anche se molto intensa, dura per un tempo brevissimo.
Da quel momento in poi verrà registrata (ad un potenziale prestabilito, che viene
mantenuto costante) solo la corrente ionica
La derivazione delle correnti ioniche transmembranarie
amplificatore
Neurone piramidale con un elettrodo di vetro attaccato per la derivazione delle correnti
ioniche transmembranarie mediante la tecnica del (patch-) voltage-clamp
La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana
ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche
transmembranarie generate a tale potenziale di membrana
Potenziale di membrana
finale (Vm) costante
(mV)
20
Potenziale di riposo (Vr)
-70
0
10
20
Tempo (ms)
30
40
Corrente ionica (nA)
60
Corrente transmembranaria
generata dal passaggio di
Vm da –70 mV a +20 mV
40
20
0
-20
-40
-60
0
10
20
30
40
Tempo (ms)
Vantaggi del voltage-clamp:
In genere, gm = f(V,t) ma,
1.
Vm è bloccato ad un valore costante  gm = f(t) soltanto e può essere dedotto dall’andamento
della corrente ionica Ii
2.
E’ possibile separare Ii da Ic. Infatti cm è caricata istantaneamente
Voltaggio (mV)
Separazione farmacologica delle correnti IK e INa
20
-70
0
10
20
Tempo (ms)
30
40
+ TTX (IK)
INa+IK
Corrente ionica (nA)
60
40
20
0
+ TEA (INa)
-20
-40
-60
0
10
20
Tempo (ms)
30
40
Considerazioni teoriche
Studio del gating allo stato stazionario
Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1o
ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating
a
C
O
b
Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato
aperto può essere descritta da:
(1-Po)
a
b
Po
Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:
dPo
 a (1  Po )  bPo
dt
Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:
a
quindi,
P 
o
ab
dPo
 a (1  Po )  bPo  0
dt
Voltaggio-dipendenza dei canali Kv
140
120
100
+
I(K ) max (nA)
Voltaggio (mV)
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
80
60
40
IK=gK• (V-EK)
20
0
-70
0
10
20
30
-20
40
-30 -20 -10 0
Tempo (ms)
10 20 30 40 50 60
Voltaggio (mV)
140
1.0
120
Conduttanza (μS)
Corrente K + (nA)
100
80
60
40
0.8
0.6
0.4
gK = IK/(V-EK)
20
0.2
0
0.0
-20
0
10
20
Tempo (ms)
30
40
EK=-80 mV
-30 -20 -10 0
10 20 30 40 50 60
Voltaggio (mV)
Voltaggio-dipendenza dei canali Na
1
0
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
-50
-1
I(Na) picco (nA)
Voltaggio (mV)
60
-2
-3
-4
-6
-70
-7
0
1
2
3
4
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40
0
-1
-2
-3
-4
-5
0.12
gNa = INa/(VENa)
0.10
ENa=+50 mV
0.14
0
1
2
Tempo (ms)
3
4
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40
0
1
2
Tempo (ms)
60
Voltaggio (mV)
Conduttanza (μS)
I(Na) (nA)
I(Na) (nA)
Tempo (ms)
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
INa=gNa• (V-ENa)
-5
3
4
Voltaggio (mV)
Separazione della fase di attivazione della corrente
di Na dall’inattivazione
La pronasi rimuove l’inattivazione
0
Corrente di Na (nA)
Voltaggio (mV)
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80
-90
-200
-400
-600
-800
0
10
20
30
40
-80
tempo (ms)
-60
-40
-20
0
20
40
Voltaggio (mV)
0
2.5
-200
2.0
-400
-600
-800
-1000
1.5
0.5
1.0
0.5
-1200
0
0
10
20
tempo (ms)
30
40
0
-80
-60
-40
-20
0
Voltaggio (mV)
20
40
Prob. canale aperto
Conduttanza ( m S)
Corrente (nA)
1
Come risalire dai valori di conduttanza allo stato stazionario
alla probabilità di trovare una singola gate del canale aperta
Grafico della conduttanza g(V) allo stato stazionario
Nel caso di un canale inattivante, esso è stato ottenuto
rimuovendo l’inattivazione
2.5
Gmax
2.0
1.5
0.5
1.0
0.5
0
Prob. canale aperto
C onduttanza ( m S)
1
0
-80 -60 -40 -20
0
20
g  (V )  Po
g
Po 
Gmax
40
Voltaggio (mV)
Ipotesi: l’attivazione del canale è regolata da x gates n uguali e indipendenti.
Allora, se n∞ è la probabilità di avere la singola gate n aperta allo stato stazionario, la probabilità Po di
trovare il canale aperto allo stato stazionario (in assenza di inattivazione) sarà:
Po  n
x
Probabilità composta: n·n·n…. (x volte)
Quindi, dai valori di Po si può risalire ai valori di n∞:
n  x Po
Studio dell’inattivazione allo stato stazionario
0 mV
1.2
1
-40
-60
-80
-100
-120
0
1
2
3
4
Tempo (ms)
5
6
7
0.2
Corrente di Na (nA)
Vm (mV)
-20
1.0
0.8
0.6
0.5
0.4
0.2
0.0
Probabilità gate h aperta
0
0
0.0
-120
-0.2
-100
-80
-60
-40
-20
Potenziale di condiz. (mV)
0
INa (nA)
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
-1.2
0
1
2
3
4
Tempo (ms)
5
6
7
Se si ipotizza che il processo di inattivazione
sia regolato da un’unica gate (h), i valori in
grafico sono proporzionali alla probabilità di
trovare tale gate aperta allo stato stazionario
Tempo-dipendenza del gating
Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1o
ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating
a
C
O
b
Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato
aperto può essere descritta da:
(1-Po)
a
b
Po
Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:
dPo
 a (1  Po )  bPo
dt
Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:
a
quindi,
P 
o
dPo
 a (1  Po )  bPo  0
dt
ab
Risolvendo l’equazione differenziale del 1o ordine e applicando
la condizione al contorno Po0  Po(t  0), si ottiene:


Po(t )  Po0  (Po  Po0 ) 1  e (a  b )t

1/(ab)=t rappresenta la costante di tempo dell’attivazione ed è
un indice della velocità di attivazione della particella di gating.
Se p particelle di gating indipendenti
sono coinvolte nel gating del canale,
allora il canale seguirà il seguente
andamento temporale: Pochann (t )  Po(t )p
Prob. Di Attivaz.
1.0
Po(t)
0.8
0.6
[Po(t)]p
0.4
0.2
0.0
0
2
4
Tempo
6
8
60
-70
160
140
120
100
80
60
40
20
0
-20
Prob. di apertura (Po)
I(K)
Voltaggio (mV)
Cinetica delle correnti di K+ del canale Kv
1.0
0
10
20
Tempo (ms)
30
40
Ipotesi: una sola gate
Po=n(t)=n∞-(n∞-n0)∙exp(-t/τ)
I=g∙(V-E) ; gPo I(t)n(t)∙(V-E)
I=g∙(V-E) ; gPo=n4  I(t)n4(t)∙(V-E)
0
10
20
Tempo (ms)
30
chiuso
aperto
-70mV
+60mV
40
Ipotesi: quattro gates identiche
Po= n∙n∙n∙n = n4
n4(t)=[n∞-(n∞-n0)∙exp(-t/τ)]4
1 gate
0.8
4 gates
0.6
0.4
0.2
0.0
0
10
20
Tempo (ms)
30
40
chiuso
aperto
Volt. (mV)
Cinetica delle correnti di Na+ voltaggio-dipendenti
20
-70
0
10
20
30
40
Ipotesi: tre gates identiche
Po=m3(t)=[m∞-(m∞-m0)∙exp(-t/τ)]3
Tempo (ms)
0
I(Na)
-5
-10
-15
Chiuso
Aperto
-70mV
+20mV
-20
-25
0
10
20
30
40
Prob. di apertura (Po)
Tempo (ms)
m(t)
1.0
Ipotesi:
tre gates identiche di attivazione
+
una gate di inattivazione
Po=m3(t)∙h(t)
h(t)
0.8
m3(t)
0.6
0.4
0.2
m3*h
0.0
0
10
20
Tempo (ms)
30
40
Chiuso
Aperto
Inattivato
-70mV
+20mV
+20mV
Il gating dei canali
voltaggio-dipendenti
ovvero
Come fa il voltaggio ad aprire i canali?
Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è
la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del
signalling
Canali ionici voltaggio-dipendenti
Famiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM)
Questa è una delle 4
(pseudo)subunità
H5
Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità
Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P)
I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci
Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio
Vi appartengono:
Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+
Canali del K+ Ca2+-attivati
Canali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.
K+ channel
OUT
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
S6
IN
N
Na+ channel
X4
P
OUT
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
C
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
IN
C
N
Ca2+ channel
OUT
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
+
+
S1 S2 S3 S4 S5
+
+
P
S6
IN
N
C
2
2
4
4
5
5
Attiva la
spirale
Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici
regolarmente distribuiti ogni 3 aa.
Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer
Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o
residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer
Mutazioni in S4 Riducono il
Movimento di Carica
1
4
2
q/n
0
(e- charges)
-2
-4
K=lisina
R=arginina
2
3
4
5
6
7
ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL
R K
R neutral AA
Mutazioni in S4 Riducono il
Movimento di Carica
1
4
2
q/n
0
(e- charges)
-2
-4
2
3
4
5
6
7
ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL
R K
R neutral AA
MacKinnon_Nature01473.pdf
MacKinnon_Nature01580.pdf
MacKinnon_Nature01581.pdf
Confronto della voltaggio-dipendenza di gK e gNa
1.0
Conduttanza g
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-60
-40
-20
0
Vm (mV)
20
40
60