Analisi interazioni DNA-proteine:
saggio di footprinting
Analisi interazioni DNA-proteine:
saggio EMSA
Sistemi di espressione
• In vitro (estratti cellulari)
• In vivo (cellule in coltura)
• Animali transgenici
B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007
Gene reporter
I confini di un promotore possono essere determinati
mediante analisi di delezioni progressive
attività
reporter
100
reporter
100
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100
reporter
100
reporter
30
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0
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Metodi di trasfezione
• fosfato di calcio
• liposomi (e simili)
• elettroporazione
• infezione (SV40, retrovirus)
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Trasfezione in cellule in coltura
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Vettori episomali
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Trasfezione di cellule in coltura
• transiente
• stabile
• vettori episomali
Vettori di
clonaggio
per lievito
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Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Studio della localizzazione intracellulare della proteina
SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae
A) Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con
"tag" (GFP)
B) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western
blot di estratti frazionati
Parte A
I)
1. PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare)
2. Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina
3. Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione
II) 1. Reazione con enzima "ligasi"
2. Analisi su gel di agarosio
3. Analisi spettrofotometrica del DNA preparato
4. Trasformazione batterica
5. Preparazione piastre di agar
III) 1. Analisi risultati trasformazione
2. Minipreparazione DNA plasmidico
3. Analisi su gel di agarosio
Clonaggio con doppia digestione
BamHI
EcoRI
GAATTC AAGCTT
CTTAAG TTCGAA
EcoRI
BamHI
Sec 4
AGCTT
G
A
CTTAA
pUG34
DNA ligasi
PCR da DNA
genomico
PCR da DNA
plasmidico
EcoRI
BamHI
Sec 4
EcoRI
BamHI
Sec 4
Reazione di ligasi
• strategie
• controlli
Controlli nella ligasi
AGCTT
G
A
CTTAA
?
DNA ligasi
Piastra 1
pUG34
AGCTT
G
A
CTTAA
DNA ligasi
P. 2
pUG34
Sec 4
Visualizzazione del DNA
DNA circolare con
superavvolgimento = 0
DNA superavvolto
negativamente
Vettore pUG34
PCR da plasmide
PCR da genomico
DNA genomico
Marcatore 200 ng
Vettore pUG34
PCR da plasmide
PCR da genomico
DNA genomico
Vettori di espressione inducibili
Espressione proteine
di fusione
Proteine di fusione
prom
Tag o rep.
cDNA
trascrizione
traduzione
term
Estrazione DNA
plasmidico (vettore)
PCR DNA genomico
DigestioneEstrazione
DNA plasmidico
(vettore)
Digestione PCR DNA
genomico
Elettroforesi
Ligasi vettore
(controllo)
1. Trasformazione
ligasi di controllo
Ligasi vettore +
inserto
2. Trasformazione
ligasi
Miniprep controllo
X
1.PCR
2.Vettore
3.marcatore
3. Trasformazione
controllo cellule
Miniprep
Y
Miniprep controllo
Z
Elettroforesi
1.X
2.Y
3.Z
Trasformazione
lievito
Trasformazione
lievito di controllo