Fabrizio Loreni Tel. 0672594317 E-mail [email protected] Antonella Ragnini Tel. 0872 570317 E-mail [email protected] Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio nuova edizione Anno/Pagine: 2001 pp. 800 Euro: 99,00 REED Rob , HOLMES David , WEYERS Jonathan , JONES Allan METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARI volume unico p.344 Euro 37,50 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae A) Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) B) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A 1) Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte) 2) Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte) Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 3) Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione 4) Analisi su gel di agarosio Reazione con enzima "ligasi" 5) Preparazione piastre di agar Trasformazione batterica 6) Analisi risultati trasformazione Minipreparazione DNA plasmidico 7) Analisi su gel di agarosio 8) Fasi iniziali di Southern blot Parte B 9) Trasformazione con plasmidi ricombinanti di cellule di lievito inoculo per la preparazione di estratti proteici 10) Controllo trasformazione Preparazione degli estratti con glass beads e TCA. Frazionamento degli estratti 11-12) Bradford analysis e preparazione SDS-PAGE 13-14) Caricamento, corsa e Westernblotting (4h) 15-16) Immunodetection ECL. Discussione generale Acidi nucleici come materiale di studio • DNA endogeno • DNA esogeno (transgeni) • RNA strutturale • mRNA Isolamento acidi nucleici • lisi cellulare • deproteinizzazione • precipitazione Metodi di lisi cellulare Tecnica Applicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi litici Cellule animali e vegetali Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti Sfere di vetro Batteri e funghi Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press) Microorganismi Ultrasonicazione Microorganismi Purificazione acidi nucleici • Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici • Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo Isolamento DNA plasmidico • Protocollo “artigianale” • Colonnine cromatografiche (kit commerciali) Protocollo artigianale Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE Isolamento DNA da cellule eucariotiche Isolamento DNA Isolamento RNA Purificazione mRNA Analisi acidi nucleici • Spettrofotometro • Elettroforesi su gel Spettro di assorbimento del DNA 1.5 Assorbanza (OD) 1.0 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0 0.5 220 240 260 280 300 lunghezza d’onda (nm) 320 Amplificazione DNA • Clonaggio • PCR Clonaggio Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi) Introduzione nella cellula ospite Selezione Minipreparazione di plasmidi per verifica Vettori plasmidici Reazione di ligasi • strategie • controlli Trattamento del vettore con fosfatasi pAATTC G G CTTAAp AATTC G G CTTAA fosfatasi DNA ligasi pAATTC G G CTTAAp EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Clonaggio con doppia digestione EcoRI HindIII GAATTC AAGCTT CTTAAG TTCGAA AGCTT G A CTTAA DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA Metodi di trasformazione dei batteri •Metodo del cloruro di calcio •Elettroporazione Strategie di selezione nel clonaggio Vettori plasmidici Strategie di selezione nel clonaggio Vettori di espressione Vettori di espressione inducibili Espressione proteine di fusione PCR (polymerase chain reaction) PCR • Scelta dello stampo • Scelta dei primer PCR da DNA genomico PCR da mRNA (RT-PCR) Uso dei “linkers” Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ PCR da DNA genomico BamHI EcoRI
Scarica
