Spettrometria di massa
• Separazione di ioni in fase gassosa in
funzione della loro massa molecolare
• Analisi di frammenti che si generano per
attivazione e selezione di un singolo ione
Spettrometro di massa
Sorgente
Analizzatore
m/z
Rivelatore
Sorgenti
• Ionizzazione diretta
– EI, CI
• Desorbimento
– FAB
– MALDI
• Nebulizzazione
– ESI
Ionizzazione diretta
MS & Proteomics
Spettro ESI del Tripsinogeno (MW 23983)
M + 15 H+
Relative Abundance
1599.8
M + 16 H+
M + 14 H+
1499.9
1714.1
M + 13 H+
1845.9
1411.9
1999.6
2181.6
m/z
Mass-to-charge ratio
Calcolo accurato della massa (MR = 23983 Da)
•
•
•
•
(M+n+3)/(n+3) = 1499.9
(M+n+2)/(n+2) = 1599.8
(M+n+1)/(n+1) = 1714.1
(M+n)/n = 1845.9
n = 13
1599.8
1499.9
1714.1
1411.9
1845.9
1999.6
2181.6
•
•
•
•
(M+16)/16 = 1499.9  23982.4
(M+15)/15 = 1599.8  23982.0
(M+14)/14 = 1714.1  23983.4
(M+13)/13 = 1845.9  23983.7
Quadrupolo
Uses a combination of Radio
Frequency(RF) and Direct
Current(DC) voltages to
operate as a mass filter.
• Has four parallel metal
rods.
• Lets one mass pass
through at a time.
• Can scan through all
masses or sit at one
fixed mass.
Matrix Assisted Laser Desorption
(MALDI)
Matrix Assisted Laser Desorption
(MALDI)
Schema esemplificato del processo di ionizzazione MALDI
time-of-flight (TOF)
Ion Source
Flight Tube
20-25 kV
Detector
Principle: If ions are accelerated with the same potential at a
fixed point and a fixed initial time and are allowed to drift, the
ions will separate according to their mass to charge ratios.
time-of-flight (TOF)
Ion Source
Flight Tube
Detector
The ions enter the flight tube with the lighter ions
travelling faster than the heavier ions to the detector
time-of-flight (TOF)
Ion Source
Flight Tube
Detector
The lighter ions strike the detector before the heavier ions.
This “time of flight” (TOF) can be converted to mass
MALDI/TOF MASS SPECTROMETRY
Spetto MALDI/TOF di IgG
MH+
Relative Abundance
40000
30000
(M+2H)2+
20000
10000
(M+3H)3+
0
50000
100000
m/z
150000
200000
Mass Analyzers
Analyzer
System Highlights
Quadrupole
Unit mass resolution, fast scan, low cost
Sector (Magnetic and/or
Electrostatic)
High resolution, exact mass
Time-of-Flight (TOF)
Theoretically, no limitation for m/z maximum,
high throughput
Ion Cyclotron Resonance (ICR)
Very high resolution, exact mass, perform ion
chemistry
Risoluzione e sensibilità
Risoluzione MALDI
Peptide mass fingerprinting
Limiti del
peptide mass fingerprinting
• La proteina non è presente nel database
• La proteina è ricca di modificazioni
co/post-traduzionali
• Lo spot nasconde più di una proteina
La sorgente ESI può essere collegata
all’uscita di un sistema di separazione
0.18mm X 15cms C18 column
400nl/min
7:1 flow split
Mass spectrometer
4µl/min
LC
Fraction collector
Further MS analysis
MS/MS
Quadrupolo
m2
m4
m1
m4
m3
m2
m2
m2
m1
m3
mass scanning mode
m2
m4
m1
m3
m2
single mass transmission mode
m2
Tandem MS
MS/MS
Frammentazione dei peptidi
LC-MS-MS
Isotope-coded affinity tagging
ICAT
ICAT
ICAT
iTRAQ
Activity-based protein profiling
Protein arrays
Protein arrays
Protein arrays