COS’E’ IL PROTEOMA?
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“PROTEins expressed in a functional
genOMA”

relazione con lo spazio

relazione con il tempo
STRUMENTI PER LO STUDIO
DEL PROTEOMA
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Elettroforesi bidimensionale (2-DE)
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Analisi di immagine (scanner)
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Spettrometria di massa ( MALDI- TOF; ESI)
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Ricerca in database on line
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Microsequenziamento
2-DE (Elettroforesi bidimensionale)
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Una tecnica “vecchia” di 30 anni (1970)
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Perche solo ora?
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Combinazione di SDS-PAGE e IEF
2-DE (Elettroforesi bidimensionale)
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PrimaIEF
“Prima dimensione”:
Separazione per pI (punto isoelettrico)

“Seconda dimensione”: SDS-PAGE
separazione per massa molecolare
IEF (isoelettrofocalizzazione)
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Separazione su gradiente di pH delle proteine
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Migrazione che si arresta al pI
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Dalle “anfoline” alle “immobiline”
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le “strips”
IEF ( strips e gradiente)
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Strips
facilmente manipolabili
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Gradiente
dalle anfoline alle immobiline
SDS - PAGE
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Elettroforesi denaturante su gel
di p-acrilammide
sodio dodecil solfato (SDS)
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Separazione secondo la massa
tutte le proteine sono cariche negativamente
MAPPA PROTEICA
pH 4-9
STRIP -1D
SDS-PAGE - 2D
MAPPA PROTEICA
Xilema di eucalipto
STRIP -1D
SDS-PAGE - 2D
•Colorazioni
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Metodi freddi
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silver staining
comassie blue (colloidale)
ponceau red
Fluorescenza (2,4- difenilossazolo)
Ab e chemioluminescenza
Metodi caldi
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35S, 14C, 3H, 32P
Trasferimento su membrana
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Western blot (elettroblotting)
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supporto maneggevole
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conservazione
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isolamento di spots proteici
Acquisizione e analisi
dell’immagine
Il “decollo” del PROTEOMA
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Spettrometria MALDI- TOF
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Spettrometria ESI
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Microsequenziamento
Digestione in gel
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Lo spot proteico viene
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decolorato
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frammentato in peptidi
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cristallizzato su una matrice solida
Spettrometria di massa


In un tubo sotto vuoto applicando una
ddp. si formano elettroni e radiazioni
positive (J.J. Thompson, inizio 900)
Spettrometro di massa:


Separa ioni in fase gassosa per rapporto
carica/massa
strumento analitico che misura la massa
molecolare di uno ione (PEPTIDE)
Spettrometria di massa


Separazione di ioni in fase gassosa secondo
il rapporto carica/massa
Fasi dell’analisi





introduzione del campione
ionizzazione (MALDI o ESI)
separazione (TOF o ION-TRAP)
rivelazione
elaborazione
Sorgente: MALDI

Sorgente:


Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
La proteina cristallizzata è:



colpita dal LASER evapora
ionizza per protonazione
spettri semolici (monocarica)
Analizzatore TOF

Tubo di lunghezza definita




sotto vuoto
assenza di campo elettrico
I peptidi vengono accelerati e “spiccano” il
volo
Ec=mv2/2




molecole piccole…balzi grandi
molecole grosse…balzi piccoli
5 attomoli /ul
masse da 500 Da a 150 KD
Sorgente: ESI


Ionizzazione per elettronebulizzazione
particelle liquide cariche da cui gli ioni
vengono emessi per desolvatazione
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ioni multicarica
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spettri complessi
Analizzatore ION-TRAP

Analizzatore a quadrupolo (“filtro ionico”)

Ion trap: quadrupolo tridimensionale

elevata sensibilità

elevata risoluzione

selezione di uni ione (MS/MS)
Frammentazione di un peptide
Banche dati

Dallo spettrometro si ottengono
NUMERI!!


Rapporti carica/massa
Questi valori (spettri) vengono inseriti in
database:



EMBL (Europe)
GenBank (USA)
SWISS PROT
Banche dati : Tipi di
identificazione

Peptide mass fingerprinting

masse ottenute vs masse virtuali di peptidi ottenuti “in silico” dele
proteine presenti nel database

Peptide fragment ion search

massa ottenuta tramite MS/MS vs tutte le masse virtuali generabili
dal database proteico

Peptide sequence tag

sequenza desunto da MS/MS vs i frammenti generati “in silico” dal
database
Banche dati : Tipi di
identificazione
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FASTA
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BLAST
Microsequenziamento



Chimica di EDMAN
Non rientra propriamente nel Progetto
Proteoma
Di grande aiuto per la correlazione con
sequenze geniche
CONCLUSIONI

SEPARAZIONE SISTEMATICA di PROTEINE

IDENTIFICAZIONE

QUANTIFICAZIONE

Diff. CELLULARE, MARCATORI per MALATTIE,
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NEW DRUGS

SOSTANZIALE EQUIVALENZA