CITOGENETICA E
APPLICAZIONI
DIAGNOSTICHE

La citogenetica classica e molecolare è associata alla
diagnostica Morfologica, Fenotipica.

Le malattie ematologiche nelle quali si realizza
routinariamente sono sempre più numerose.
Serravalle Salvatore
L’ESAME
EMOCROMOCITOMETRICO
Nel midollo esistono due grandi categorie (o serie ) di cellule:
la linfoide (che comprende un tipo di globuli bianchi, i linfociti, e le
plasmacellule che da essi originano) e la mieloide ( detta anche non linfoide)
che comprende in pratica tutti gli altri tipi di cellule (globuli rossi, globuli
bianchi, piastrine e loro precursori).
Le cellule più immature di entrambe le serie vengono chiamate blasti ed in
condizioni normali sono meno del 5% di tutte le cellule midollari.
Rappresentazione schematica della cascata differenziativa.
Tutte le cellule del sangue si originano nel midollo osseo da una popolazione di cellule staminali
pluripotenti che, differenziandosi, seguono una definita cascata differenziativa:
la neoplasia può insorgere in una delle diverse fasi della via di maturazione linfoide o mieloide.
DEFINIZIONE
A. Se la trasformazione tumorale riguarda i blasti
della serie linfoide si parla di leucemia linfoblastica
acuta (ALL);
B. Negli altri casi si parla di leucemia mieloide acuta
(AML);
altri sinonimi per questa malattia sono leucemia mieloblastica acuta (AML)
o non linfoblastica acuta (ANLL) Nelle leucemie acute i blasti midollari sono in genere
superiori al 30%.
CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE NEOPLASTICHE
DEL TESSUTO EMOPOIETICO E LINFOIDE
World Health Organization - 1997
NEOPLASIE MIELOIDI
Malattie mieloproliferative
Leucemia Mieloide Cronica, cromosoma Philadelphia
positiva [t(9;22)(q34;q11), bcr/abl]
Leucemia cronica neutrofilica
Leucemia cronica eosinofilica / sindrome ipereosinofila
MieloFibrosi Idiopatica cronica
Policitemia Vera
Trombocitemia Essenziale
Malattia mieloproliferativa non classificata
Malattie mielodisplastiche / mieloproliferative
Leucemia MieloMonocitica Cronica
Leucemia mieloide cronica atipica
Leucemia mielomonocitica giovanile
Sindromi mielodisplastiche
Anemia Refrattaria
con sideroblasti ad anello
senza sideroblasti ad anello
Citopenia refrattaria (sindrome mielodisplastica)
con displasia multilineare
Anemia Refrattaria (sindrome mielodisplastica)
con Eccesso di Blasti
Sindrome 5qSindrome MieloDisplastica non classificata
Leucemie Acute Mieloidi
LAM con traslocazioni citogenetiche ricorrenti:
LAM con t(8;21)(q22;q22), aml1(cbfa )/eto
LA Promielocitica [LAM con t(15;17)(q22;q21) e var, pml/rara]
LAM con eos. mid. [inv(16)(p13;q22) o t(16;16), cbfb/myh11]
LAM con anomalie 11q23 (mll)
LAM con displasia multilineare
con precedente sindrome mielodisplastica
senza precedente sindrome mielodisplastica
LAM e sindromi mielodisplastiche correlate a terapie
correlate ad agenti alchilanti
correlate a epipodofillotossine
altri tipi
LAM non altrimenti classificate
LAM scarsamente differenziata, M0
LAM senza maturazione, M1
LAM con maturazione, M2
LA promielocitica, M3
LA mielomonocitica, M4
LA monocitica, M5
LA eritroide, M6
LA megacariocitica, M7
LA basofilica
Panmielosi acuta con mielofibrosi
Leucemie acute bifenotipiche
CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE NEOPLASTICHE
DEL TESSUTO EMOPOIETICO E LINFOIDE
World Health Organization - 1997
NEOPLASIE LINFOIDI
Neoplasie delle cellule B
Neoplasie dei precursori B
Leucemia / linfoma B linfoblastica (Leucemia Acuta Linfoblastica B)
Neoplasie delle cellule B mature (periferiche)
Leucemia Linfocitica Cronica B / linfoma a piccoli linfociti B
Leucemia prolinfocitica B
Linfoma linfoplasmocitico
Linfoma splenico B delle zona marginale (+/- linfociti villosi)
Leucemia a cellule capellute
Mieloma a plasmacellule / plasmocitoma
Linfoma extranodale B delle zona marginale di tipo MALT
Linfoma nodale B delle zona marginale (+/- cellule B monocitoidi)
Linfoma Follicolare
Linfoma a cellule Mantellari
Linfoma Diffuso a Grandi Cellule B
linfoma a grandi cellule B del mediastino
linfoma primary effusion
Linfoma di Burkitt / leucemia a cellule di Burkitt
Neoplasie delle cellule T e NK
Neoplasie dei precursori T
Leucemia / linfoma T linfoblastica (Leucemia Acuta Linfoblastica T)
Neoplasie delle cellule T mature (periferiche)
Leucemia prolinfocitica T
Leucemia linfocitica T granulare
Leucemia a cellule NK aggressive
Linfoma / leucemia T dell’adulto (HTLV1+)
Linfoma extranodale NK/T, tipo nasale
Linfoma T, tipo enteropatia
Linfoma T epatosplenico gamma-delta
Linfoma T sottocutaneo tipo panniculite
Micosi Fungoide / Sindrome di Sezary
Linfoma anaplastico a grandi cellule, T / null, tipo primitivo cutaneo
Linfoma a grandi cellule T periferiche, non altrimenti classificato
Linfoma T angioimmunoblastico
Linfoma anaplastico a grandi cellule, T / null, tipo primitivo sistemico
Linfoma di Hodgkin (LH)
DISORDINI LINFOPROLIFERATIVI POST-TRAPIANTO (PTLD)
NEOPLASIE DELLE MAST CELLULE
NEOPLASIE DELLE CELLULE ISTIOCITICHE E DENDRITICHE
Leucemie acute linfoblastiche (ALL)
70%
Leucemie acute non linfoblastiche (AML) 30-40%
Leucemie mieloidi croniche (LMC)
3%
Leucemie linfocitiche croniche (CLL)
rare
Relazioni evidenti tra INSORGENZA MALATTIA e PRESENZA
di ALTERAZIONI CROMOSOMICHE
 sono coinvolti
Geni per fattori di trascrizione

Anomalie regolazione del sistema emopoietico e dei processi
apoptotici
Geni coinvolti nei tumori
GENI
MUTATORI:
responsabili
del
mantenimento
dell’integrita’ del genoma durante le replicazione cellulare.
ONCOGENI: geni la cui azione promuove positivamente la
proliferazione cellulare.
ONCOSOPPRESSORI (TS): i prodotti di tali geni inibiscono la
proliferazione cellulare.
Geni di Fusione
• Si definiscono geni di fusione gli oncogeni
associati a traslocazioni cromosomiche specifiche,
generati dalla ricombinazione tra due geni.
• Danno origine a m-RNA chimerici il cui prodotto
e’ espresso ed e’ neoplastico se entrambi i due
oncogeni sono funzionanti.
• Un tipico esempio e’ l’oncogene PML-RAR alfa
associato alla t(15;17) ed alla Leucemia Acuta a
promielociti.
Cellule normali e cancerose
CELLULE NORMALI
CELLULE CANCEROSE
 INIBIZIONE
DA CONTATTO
 PERDITA
INIBIZIONE
DA CONTATTO
 INCAPACI DI CRESCERE IN
SOSPENSIONE
(ECCEZIONE I LINFOCITI)
 CRESCONO IN SOSPENSIONE
 DIPENDENTI DAI
FATTORI DI CRESCITA
 INDIPENDENTI DA
FATTORI DI CRESCITA
 MORTALI
 IMMORTALI
CITOGENETICA : Processo di analisi che valuta il numero e la forma dei cromosomi.
5 avvolgimenti
2nm
della doppia elica
sezione della
11nm
cromatina
fibra di 30nm con
nucleosomi
strettamente
i
30nm
impacchettati
parte di una sezione
di cromosoma
sezione condensata
di un cromosoma
300nm
700nm
metafasico
cromosoma
metafasico
1400nm
Le cellule umane contengono 46 cromosomi.
I geni, cioè frammenti specifici di DNA,
sono i principali costituenti dei cromosomi.
In un singolo cromosoma sono mediamente
presenti 2.000 geni.
I cromosomi X e Y, sono quelli che
determinano il sesso:
Nella donna sono presenti due cromosomi
X,e nell’uomo un X e un Y.
CITOGENETICA
CARIOTIPO
Il cariotipo si esegue sull’immagine dei 46 cromosomi ottenuta mediante
fotografia o immagine computerizzata.
Costituita da 22 coppie appaiate, nelle quali uno dei cromosomi è di origine
paterna ed una di origine materna.
Sono distinti a seconda della lunghezza (dal più lungo al più corto) ed in base
alle caratteristiche morfologiche (visibile con la tecnica del “bandeggio”).
I cromosomi del sesso (XX o XY) vengono evidenziati come coppia separata.
Costituenti del cromosoma
Lunghezza del cromosoma
TELOMERO
p
COSTRIZIONE SECONDARIA
CENTROMERO
(COSTRIZIONE PRIMARIA)
q
TELOMERO
Lab.Oncoematologia
pediatrica (BO)
CARIOGRAMMA BASATO SULLA LUNGHEZZA CROMOSOMICA
E SULLA POSIZIONE DEL CENTROMERO
METAFSE
METAFASE CON NUCLEO IN INTERFASE
GRUPPO
CROMOSOMI
CARATTERISTICHE
A
B
C
1, 2, 3
4, 5
6, 7, 8, 9, 10,11,12
Cromosomi grandi con centromeri in posizione mediana.
Cromosomi grandi con centromeri sub-mediani.
Cromosomi di media grandezza con centromeri sub-mediani
D
E
F
G
13, 14, 15
16, 17, 18
19, 20
21, 22
Cromosomi di media grandezza con centromeri terminali.
Cromosomi piccoli con centromeri mediani e sub-mediani.
Cromosomi piccoli con centromeri mediani.
Cromosomi molto piccoli e acrocentrici.
BANDEGGIAMENTO CROMOSOMICO
Lo sviluppo del bandeggiamento (Caspersson, 1968 ) ha costituito un progresso decisivo
per le analisi citogenetiche e ha permesso di individuare singoli cromosomi.
Vari trattamenti denaturanti consentono di colorare cromosomi, modo riproducibili
secondo una sequenza di bande chiare e scure.
Il numero del cromosoma è seguito da
p (braccio corto) o q (braccio lungo) e
dal numero della banda, esempio 11q23
significa, l’estremità del braccio lungo
q del cromosoma 11, banda 2
sottobanda 3.
.
Aspirato midollare
(sangue periferico)
Conteggio nucleate
Semina in terreno
Coltura per 24 - 72 h
Cariotipo Convenzionale
(CC)
Colorazione (bandeggio)
Selezione e cattura immagini
Elaborazione e cariotipizzazione
Colchicina
Fissazione e lavaggi
Allestimento
dei vetrini
Conclusione diagnostica
Bandeggio GTG (G-Trypsin-Giemsa):
Lab.Oncoematologia
pediatrica (BO)
-E’ uno dei bandeggi più largamente utilizzati. Consiste nel trattare i cromosomi con
un enzima proteolitico, la tripsina, che digerisce le proteine istoniche.
- In seguito si immergono i vetrini in una soluzione di Giemsa, una miscela di azur II
ed azur II eosina, e questo consente la visualizzazione delle bande cosiddette G.
METAFASE DA
ORDINARE
Lab.Oncoematologia
pediatrica (BO)
CARIOTIPO COSTITUZIONALE: METAFASE ORDINATA
La standardizzazione internazionale della nomenclatura dei cromosomi umani del 1981
aggiornata nel 1995 (ISCN 1995) identifica ciascuna banda e sottobanda cromosomica in
400, 550 ed 850 bande.
Bandeggio QFQ (Q-Fluorescence-Quinacrine):
-Il bandeggio Q-Fluorescence-Quinacrine è costituito da una colorazione fluorescente.
-E’analogo a quello G.
- Il contrasto inoltre è inferiore a quello ottenibile con il bandeggio G (Gravholt and Friedrich 1995).
Alterazioni:
2p5q11q+
Lo svantaggio di questa tecnica deriva
dal fatto che la fluorescenza decade
rapidamente per cui il bandeggio è
temporaneo.
Bandeggio CBG (C-Barium-Giemsa):
-Questa tecnica prevede un processo di denaturazione e rinaturazione grazie
all'impiego di idrossido di bario, seguita dalla colorazione con Giemsa.
- Permette di mettere in evidenza tutte le regioni centromeriche.
Quali sono le anomalie
cromosomiche
Di numero
trisomie
monosomie
triploidie
tetraploidie
Di struttura
traslocazioni
inversioni
delezioni
duplicazioni
anomalie cromosomiche di numero
ESEMPIO di TRISOMIA
Cromosoma 21
anomalie cromosomiche di numeroESEMPIO di TRISOMIA
Trisomia 13
Sindrome Patau
Trisomia 18
Sindrome Edward
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
MONOSOMIA 22
Esempio di TRIPLOIDIA 69, XXX; XXY; XYY
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
TETRAPLOIDIA
anomalie cromosomiche di struttura
Traslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piu’ fattori di
trascrizione, ma anche tirosin o serin
protein chinasi, recettori di membrana
cellulare, fattori di crescita, con ruoli
critici nella differenziazione e sviluppo
cellulare
Traslocazioni cromosomiche
• Deregolazione dell’espressione genica:
overespressione o espressione aberrante in un
tessuto che normalmente non esprime quel gene.
• Espressione di una proteina di fusione:
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di
due geni localizzati su differenti cromosomi
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
Nelle leucemie acute mieloblastiche, la
traslocazione t(8;21) induce il riarrangiamento
AML1-ETO e la formazione di una proteina
ibrida.
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
t(15;17)(q22;q21)
La traslocazione t(15;17) coinvolge
il gene che codifica per il recettore
nucleare a dell'acido retinoico (RARa)
sul cromosoma 17, ed il gene PML
(promielocitica) sul cromosoma 15.
VARIANTI
• t(11;17)(q23;q22) PLZF-RARα;
t(5;17)(q35;q21) NPM-RARα;
t(11;17)(q13;q21) NuMA-RARα;
t(17;17)(q11;q21) STAT5b-RARα;
LAM M4
LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inversione (16)
gene di fusione CBFB-MYH11
CARIOTIPO COMPLESSO : Atassia Telangectasia
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
ALTERAZIONI CROMOSOMICHE
Anemia Fanconi
INTERRUZIONE CROMATINA CROMOSOMA 2 BRACCIO p
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
CROMOSOMA DICENTRICO
MONOSOMIA 22
La citogenetica classica permette di avere una visione globale del cariotipo e fornisce
gli spunti per ulteriori studi mirati e più approfonditi tramite FISH.
Aspirato midollare
(sangue periferico)
Conteggio nucleate
Semina in terreno
Coltura per 24 - 72 h
Cariotipo Convenzionale
(CC)
Ibridazione in Situ
(FISH)
Colorazione (bandeggio)
Scelta delle sonde
Selezione e cattura immagini
Denaturazione e
Ibridazione over night
Elaborazione e cariotipizzazione
Lavaggi e
controcolorazione
Valutazione immagini
Colchicina
Cattura / elaborazione
Fissazione e lavaggi
Allestimento
dei vetrini
Conclusione diagnostica
Conclusione diagnostica
La Citogenetica Molecolare FISH
Permette un’analisi
mirata di una regione
cromosomica
consentendo di
mettere in evidenza
riarrangiamenti di
alcune centinaia di
chilobasi.
Tale identificazione avviene mediante sonde marcate impiegando fluorocromi che
emettono a diverse lunghezze d’onda.
SONDE:
- Sonde locus-specifiche: sono sonde molto piccole che riconoscono porzioni corte del
cromosoma; vengono utilizzate per evidenziare aberrazioni che coinvolgono un gene o una
parte di esso.
- Sonde chromosome painting: riconoscono sequenze specifiche per ogni singolo
cromosoma localizzate lungo tutto il suo asse; il cromosoma appare interamente
colorato.
- Sonde centromeriche (o alfoidi): riconoscono brevi sequenze centromeriche di DNA
altamente
ripetitive, specifiche per ciascun cromosoma. Tali sonde, che generano un segnale
intenso.
- Sonde telomeriche: sono utili nell'identificazione di traslocazioni che
coinvolgono le regioni telomeriche.
SONDA (LSI) DOPPIO COLORE PER t(PML /RAR a)
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
DESCRIZIONE
METAFASE e INTERFASE NORMALI,
MOSTRANO: 4 SEGNALI
DUE VERDI (RARA regione 17q21,1)
DUE ROSSI (PML regine 15q22).
METAFASE TRASLOCATA, MOSTRA: UN
SEGNALE VERDE (RARA) UNO ROSSO (PML) e
UN SENALE DI FUSIONE DEI DUE GENI
GIALLO/BIANCO (PML-RARA)
Metafase e Interfase normale
Metafase Traslocata
L.A.M. M.4 (Leucemia Acuta Mielomonocitica con eosinofili)
Locus CBFb e relativa sonda
Risultato atteso
. .
normale
Risultato effettivo
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
patologico
. .
.
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE
(FAB M5)
ANOMALIE DELLA BANDA CROMOSOMICA 11q23 CON
RIARRANGIAMENTI DEL GENE MLL
IL GENE MLL (Myeloid/Lymphoid Leukemia), noto anche
come ALL1 (Acute Lymphoblastic Leukemia) oppure HRX
(per l’omologia con il gene Trithorax della Drosofila)
I RIARRANGIAMENTI DI QUESTO GENE SONO STATI
TROVATI INDISCRIMINATAMENTE IN:
 LEUCEMIE LINFOBLASTICHE ACUTE (LAL),
 LEUCEMIE MIELOIDI ACUTE (LAM)
 LEUCEMIE SCARSAMENTE DIFFERENZIATE O
BIFENOTIPICHE

FISH LSI DOPPIO-COLORE
Posizione del gene MLL
La presenza di una traslocazione e’ evidenziabile
dalla formazione di due segnali separati:
• segnale su cromosoma 11 con MLL :VERDE
• segnale su cromosoma traslocato: ROSSO
• segnale su cromosoma 11 normale: GIALLO

 Riarrangiamento di MLL
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
t (?:11) (?;q23) in infant LAM M5
Risultato atteso
. .
patologico
Interphase FISH
Traslocato
..
.
normale
Risultato effettivo
Normale
Risultato effettivo
Risultato effettivo
11q23 Partners
ArgBP2
4q35.1
NUOVO PARTNER DI TRASLOCAZIONE DI MLL
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
CARATTERISTICHE FISH PER TEL/AML1 ( LLA)
IN NUCLEI E METAFASI NORMALI SI HANNO I 2
SEGNALI ROSSI E 2 VERDI DISTINTI. NEI
TRASLOCATI SI OSSERVA UN SEGNALE ROSSO
(AML1 NORMALE) GRANDE, UNO VERDE (TEL
NORMALE) GRANDE, UNO GIALLO (TEL/AML1
TRASLOCATO) E UNO PICCOLO ROSSO (RESIDUO
DI AML1).
METAFASE NORMALE
METAFASE E INTERFASE TRASLOCATA
SONDE CHE COLORANO TUTTO IL
CROMOSOMA. painting
Metafase normale
Metafase con TRISOMIA
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
CEP Xp11.1-q11.1 ARANCIO / Yq12 (satellite III)VERDE
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
N-myc e amplificazione
Lab.Oncoematologia
Pediatrica (BO)
HSR: Regione a colorazione
omogenea.
La FISH consente di:
Effettuare uno screening su un numero di cellule notavolmente superiore alla citogenetica
classica.
Ridimensionare il valore prognostico negativo evidenziando la assenza di riarrangiamenti,anche
in interfase.
Rilevare riarrangiamenti criptici in cellule con cariotipo apparentemente normale.
Identificare nuovi punti di rottura delle traslocazioni.
Rilevare la presenza di fenomeni di amplificazione genica
Ottenere una maggiore precisione diagnostica.
• M-fish (Multiplex-FISH ) : uso di 24 sonde
painting in fluorescenza per tutti i cromosomi,
utile per sensibilità nei cariotipi complessi
• M-FISH e SKY: multicolor FISH con 24 sonde painting
(Speicher et al 1996; : Schrock et al1996);
M-FISH
applicazioni
• Identificazione di cromosomi marker, ring, hsr e double minutes;
• Caratterizzazione di traslocazioni complesse;
• Identificazione di inserzioni cromosomiche;
• Individuazione di riarrangiamenti ‘criptici’.
M-FISH
(Multiplex-FISH ) :
finalità
• analisi simultanea di tutto il corredo
cromosomico con un approccio rapido: un
singolo esperimento per lo studio dell’intero cariotipo;
• sistema affidabile di caratterizzazione
contemporanea di tutti i riarrangiamenti
cromosomici nella cariotipizzazione di cellule neoplastiche
M-FISH
• Assegnazione di un colore diverso ad ogni cromosoma.
A
Separazione dei 24 cromosomi
(flow sorted)
• Per ottenere la simultanea
visualizzazione di tutti i
cromosomi vengono impiegate
genoteche genomiche,
ottenute per flow sorting o
microdissezione dei
cromosomi
metafasici,marcate con 5
diversi fluorocromi o con una
combinazione degli stessi.
Marcatura dei singoli cromosomi utilizzando varie Eppendorf con le sonde marcate
combinazioni di fluorocromi
per i 24 cromosomi
B
IBRIDIZZAZIONE A 37°C PER 24/72 ORE
C
Steps di detection per visualizzare le sonde e rimuovere i nucleotidi non legati
VISUALIZZAZIONE DEI COLORI
D
Acquisizione con microscopio a fluorescenza
e camera CCD
Lunghezze d’onda selezionate e normalizzate
per ogni cromosoma
E
F
CLASSIFICAZIONE DEI COLORI
G
M-FISH
Ogni cromosoma è marcato con una combinazione unica di massimo quattro
dei cinque fluorocromi utilizzati.
Si ottiene così una
specifica fluorescenza,
o spettro, per ciascun
cromosoma
A = Rodamina
B = Texas Red
C = Cy 5
D = FITC
E = Cy 5.5
M-FISH
Le immagini sono
catturate con sei
differenti
acquisizioni
M-FISH
• Combinando le
informazioni delle
acquisizioni
effettuate con i sei
filtri passa-banda
si ottiene, infine,
l’immagine totale.
M-FISH
Marker cromosomici
• Conclusioni
• La cariotipizzazione standard è notevolmente implementata dall’utilizzo di tecniche
multicolor;
• M-FISH rappresenta un approccio ormai collaudato per l’identificazione di
cromosomi marker, riarrangiamenti complessi e/o di dimensioni piccole.
• Nei casi con 3 o più breakpoint l’analisi M-FISH/SKY ha consentito di individuare, o
ridefinire, riarrangiamenti cromosomici in almeno il 50% dei pazienti con LMA e LLA
analizzati all’esordio della malattia (Veldman et al,1997; Kakazu et al, 1999; VanLimbergen et
al, 2002; Nordgren et al, 2002; Calabrese et al, 2002);
Sviluppi futuri:
• L’aumento del numero dei fluorocromi impiegati dovrebbe migliorare
notevolmente l’efficienza dell’analisi e la risoluzione di riarrangiamenti di
piccole dimensioni (Saracoglu et al, 2001).
COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION
CGH e’ un metodo di citogenetica molecolare per
l’identificazione di modificazioni genetiche.
Le alterazioni sono classificate come guadagno di
DNA (gain) o perdita di DNA (loss).
COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION
Cellule Normali
CelluleTumorali
DNAgenomico
tumorale
DNA tumorale
marcato
FITC (verde)
Estrazione DNA
DNAgenomico
normale
Marcatura DNA
DNA normale
marcato
TRITC (rosso)
ibridizzazione
Metafasi normali
(prefissate sul vetrino)
Cattura dell’immagine con
microscopio a fluorescenza
METAFASE ACQUISITA CON MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
DAPI (controcolorante)
TRITC (normale)
FITC (tumorale)
SOVRAPPOSIZIONE
DELL’IMMAGINE
COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION
(analisi dell’immagine)
+
DNA + DNA
tumorale normale
Ibridazione su
metafasi normali
Colore giallo:
normale
Colore rosso:
perdita DNA tumorale
Colore verde:
eccesso di DNA tumorale
PROFILO:
Vantaggi:
Analisi dell’intero genoma in un solo esperimento
Elevata sensibilità per le amplificazioni geniche
Svantaggi:
Laboriosa.
Rileva solo guadagni e perdite, no riarrangiamenti bilanciati
Non è informativa sulla natura delle alterazioni cromosomiche.
CONCLUSIONI
La Citogenetica Molecolare è ormai entrata in tutti i campi
della Medicina e, in particolare in quello Ematogico.
Le sue tecniche, sempre più perfezionate, hanno permesso non
solo di ampliare le nostre conoscenze nel campo della patogenesi, ma
anche di fornire uno strumento utile per un miglior inquadramento
classificativo delle diverse forme morbose.
L’elevata sensibilità di queste tecniche permette in tutti i
pazienti con marcatore molecolare una migliore valutazione della
risposta terapeutica.