CORSO DI IMMUNOLOGIA
per il corso di Laurea in biotecnologie
a.a. 2005-2006 II semestre
DOCENTE:
Dott.ssa Vladia Monsurrò
Dipartimento di patologia
Sezione di immunologia
Universita’ degli Studi di Verona
045 8074256
[email protected]
ORARIO DELLE LEZIONI:
lunedì:
4:00-5:30
giovedì
4:00-5:30
dal 20 marzo al 25 maggio 2006
aula F Facolta’ di Scienze
PROGRAMMA LEZIONI
Mar 21 Marzo lezione 1
Generalità sul corso
Il sistema immunitario (Introduzione)
Giov 23 Marzo lezione 2
Cellule e tessuti del sistema immunitario
Lun 27 Marzo lezione 3
Riconoscimento dell’antigene:
Molecole del Sistema Immunitario:
Antigeni e anticorpi
Giov 30 Marzo lezione 4
MHC (Major histocompatibility complex)
Lun 3 Aprile lezione 5
MHC-Antigene:
Sua
captazione,
processamento e presentazione.
Giov 6 Aprile lezione 6
TCR-Antigeni tumorali e immunoterapia (in
preparazione del talk)
Lun 10 Aprile lezione 7
Maturazione, attivazione e regolazione dei
linfociti:
Maturazione dei linfociti ed espressione dei
recettori (genetica Ig e TCR)
Giov 13 Aprile lezione 8
Immunita’ e tumori
Parmiani Talk (ore 17:00)-vedi volantino
Giov 20 Aprile lezione 9
Attivazione
segnale.
linfocitaria,
Lun 24 Aprile lezione 10
Attivazione dei linfociti B e produzione di Ab
Giov 27 Aprile lezione 11
Tolleranza immunologica
Giov 4 Maggio lezione 12
Meccanismi effettori
Citochine, Immunita’ innata
Lun 8 Maggio lezione 13
Meccanismi
mediata
Giov 11 Maggio lezione 14
Meccansimi effettori dell’immunita’ umorale
Lun 15 Maggio lezione 15
Rapporti tra fisiologia e patologia
Ipersensibilità concetti generali
Ipersensibilità di tipo I
Giov 18 Maggio lezione 16
Test prove esami-recupero
Merc 7 giugno e 28 giugno
ESAMI
effettori
trasduzione
del
dell’immunita’ cellulo-
RICIRCOLAZIONE LINFOCITARIA
(RECLUTAMENTO)
Ig SUPERFAMILY
Il legame tra molecole di adesione consolida
l’interazione tra cellule adiacenti e potenzia
il segnale specifico MHC-TCR
FAMIGLIA
DELLE
INTEGRINE
LE MOLECOLE DI ADESIONE (CAM) DEI
LINFOCITI POTENZIANO LE INTERAZIONI
CON LE ALTRE CELLULE E PERMETTONO LA
MIGRAZIONE E IL RICIRCOLO DEI LINFOCITI
- superfamiglia delle immunoglobuline
- famiglia delle integrine
- famiglia delle selectine
- famiglia delle mucine
MOLECOLE DI ADESIONE (CAM= Cell Adhesion Molecule)
PERCHE’ E’ IMPORTANTE?
• Per far incontrare l’antigene e il linfocita
specifico
• Per posizionare I linfociti specifici solo in
siti di infezione
L'INTERAZIONE TRA MOLECOLE DI ADESIONE MEDIA
IL PASSAGGIO ATTRAVERSO GLI ENDOTELI VASCOLARI
E PERMETTE IL TRAFFICO LINFOCITARIO
LE CHEMOCHINE ATTIRANO
I LEUCOCITI NELLE ZONE
DI INFIAMMAZIONE
ATTRAVERSO GLI
ENDOTELI
FASI DELLO STRAVASO IN UN LINFONODO DI UN
LINFOCITA T VERGINE ATTRAVERSO UNA
VENULA A ENDOTELIO ALTO (HEV)
START
Pathways of T lymphocyte recirculation. Naive T cells preferentially leave the blood and enter lymph nodes across the high
endothelial venules. Dendritic cells bearing antigen enter the lymph node through lymphatic vessels. If the T cells recognize antigen,
they are activated, and they return to the circulation through the efferent lymphatics and the thoracic duct, which empties into the
superior vena cava, then into the heart, and ultimately into the arterial circulation. Effector and memory T cells preferentially leave the
blood and enter peripheral tissues through venules at sites of inflammation. Recirculation through peripheral lymphoid organs other
than lymph nodes is not shown.
High endothelial venules (HEVs).
B. Expression of L-selectin ligand on HEVs,
stained with a specific antibody by the
immunoperoxidase technique. (The location
of the antibody is revealed by a brown
reaction product of peroxidase, which is
coupled to the antibody) The HEVs are
abundant in the T cell zone of the lymph
node. (Courtesy of Drs. Steve Rosen and
Akio Kikuta, Department of Anatomy,
University of California San Francisco.) C. A
binding assay in which lymphocytes are
incubated with frozen sections of a lymph
node. The lymphocytes (stained dark blue)
bind selectively to HEVs. (Courtesy of Dr.
Steve Rosen, Department of Anatomy,
University of California San Francisco.) D.
Scanning electron micrograph of an HEV with
lymphocytes attached to the luminal surface
of the endothelial cells. (Courtesy of J.
Emerson and T. Yednock, University of
California San Francisco School of Medicine,
San Francisco. From Rosen SD, and LM
Stoolman. Potential role of cell surface lectin
in lymphocyte recirculation. In Olden K, and J
Parent. Vertebrate Lectins. Van Nostrand
Reinhold, New York, 1987.)
VENULE AD ENDOTELIO ALTO
(HEV=High Endothelial Venules)
I linfociti vergini circolano indiscriminatamente nei vari
organi linfoidi secondari attraverso le HEV, riconoscendo le
loro molecole di adesione.
Migration of naive and effector T
lymphocytes. A. Naive T
lymphocytes home to lymph nodes
as a result of L-selectin binding to
its ligand on high endothelial
venules, which are present only in
lymph nodes. Activated T
lymphocytes, including effector
cells, home to sites of infection in
peripheral tissues, and this
migration is mediated by E- and Pselectins and integrins. In addition,
different chemokines that are
produced in lymph nodes and sites
of infection also participate in the
recruitment of T cells to these sites
(not shown). B. The ligands for the
principal T cell homing receptors,
and the functions of these
receptors and ligands, are shown.
FAMIGLIA DELLE SELECTINE
I RECETTORI PER GLI
ANTIGENI:
• IG
• MHC
• TCR
RICONOSCIMENTO DELL’ANTIGENE :
- linfociti B
-linfociti T
antigene in forma nativa
antigene processato da
cellule accessorie
(cellule presentanti
l’antigene )
IL LINFOCITA B E IL SUO
RECETTORE PER L'ANTIGENE
Linfocita B
Immunoglobulina
Struttura molecolare delle Immunoglobuline:
i domini C e V sono tutti DOMINI
IMMUNOGLOBULINICI a foglietti  antiparalleli
LINFOCITI T E LORO RECETTORE
PER L'ANTIGENE
Linfocita T
citotossico o
CD8+
TCR
CD8
CD4
Recettore per l’antigene
Linfocita T
helper o
CD4+
STRUTTURA DEL TCR
IMMUNITA’ INNATA:
fagociti e cellule NK
RECETTORI PER L’ANTIGENE
DELLE APC PROFESSIONISTE
Macrofago:
-recettore per il mannoso
-recettore per glicani
-recettore per LPS (CD14)
-recettore Toll-simile TLR-4
Cellula dendritica:
-recettore per il mannoso
-recettore per LPS (CD14)
-recettore Toll-simile TLR-4
Bersagli del riconoscimento del sistema
immunitario innato
•
PAMPs=
Pathogen Associated Molecular
Patterns : sul microorganismo
•
PRRs =
Pattern Recognition Receptors:
sulle cellule del sistema immunitario
innato
PRRs:
• sulla membrana o intracellulari,
segnalano l’infezione (Toll-like
(TLR) receptors);
•
Mediatori di endocitosi;
•
Secreti, che attivano il complemento,
opsonizzano i microbi e possono
legare recettori di membrana.
Toll-like receptors (TLR)
Sono almeno 10 quelli riconosciuti tra i mammiferi. Tutti i loro
ligandi sono PAMPs derivati da tutte le maggiori classi di
patogeni.
L’attivazione dei TLR da parte dei prodotti microbici porta all’induzione di
numerosi geni responsabili di risposte infiammatorie e immunitarie, tra cui
quelli di citochine infiammatorie, chemochine, molecole effettrici
antimicrobiche, molecole MHC e costimolatorie.
Le APC (=Antigen Presenting Cell)
“PROFESSIONISTE” presentano l’antigene processato
ai linfociti T associato alle molecole MHC
recettore MHC legante
l’antigene processato in peptidi
Cellula
dendritica
Macrofago
Linfocita B
STRUTTURA SCHEMATICA DELLE MOLECOLE MHC
Catena :
44-47kD
Catena :
2-microglobulina,
12kD
• 2 catene polipeptidiche  e 
• associate non covalentemente
• con strutture secondarie costituite da foglietti
 e -eliche.
STRUTTURA SCHEMATICA DELLE MOLECOLE MHC
Catena :
32-34kD
Catena :
29-32kD
• 2 catene polipeptidiche  e 
• associate non covalentemente
• con strutture secondarie costituite da foglietti
 e -eliche.
Le molecole MHC-I ed MHC-II completamente
assemblate sono eterotrimeri, composti da:
1. una catena ;
2. una catena ;
3. il peptide antigenico nella tasca.
L’espressione stabile sulla membrana cellulare
richiede la presenza di tutti e tre i componenti.
cellula dendritica (DC)
Antigene nativo
Molecole MHC
Linfocita B e suoi
recettori per l’antigene
Linfocita T helper e suoi
recettori e co-recettori
per l’antigene
Antigene
Processato,
Associato a
Molecole MHC
PRESENTAZIONE DELL’ANTIGENE CAPTATO
DALL’ESTERNO E PROCESSATO
DA PARTE DI APC PROFESSIONISTE
Linfocita B
Macrofago
MHC-II e
Antigene
processato
Linfocita T helper e suoi
recettori e co-recettori
per l’antigene
Linfocita T helper e suoi
recettori e co-recettori
per l’antigene
MHC-II e
Antigene
processato
PRESENTAZIONE DELL’ANTIGENE CAPTATO DALL’ESTERNO
E PROCESSATO DA PARTE DELLE CELLULE DENDRITICHE
Cellula
dendritica
MHC-II
Antigene
processato
MHC-I
Antigene
processato
Linfocita T helper e suoi
recettori e co-recettori
per l’antigene
Linfocita T citotossico,
suoi recettori per
l'antigene e co-recettori
CD8
Le molecole
MHC-I presentano
l’ Ag ai T citotossici
Le molecole
MHC-II presentano
l’ Ag ai T helper
Gli Anticorpi
( = le immunoglobuline)
• Gli Anticorpi si legano all’ antigene sia nella fase di
riconoscimento che nella fase effettrice dell’immunita’
umorale.
• Fase di riconoscimento: anticorpo di membrana
riconosce l’antigene
• Fase effettrice: l’anticorpo libero lega l’antigene e:
 si neutralizzano microbi o prodotti microbici tossici
 Si attiva il sistema del complemento
 Si opsonizzano gli antigeni
 Avviene la citotossicita’ cellulare mediata da anticorpi
(immunita’ innata) o da ipersensibilita’ immediata
(attivazione dei mastociti)
• Dove si trovano?
Nella parte fluida del sangue: siero.
Nelle secrezioni mucose (IgA)
Poco nel fluido interstiziale
Sulle membrane dei linfociti B (e nel RE e
Golgi)
Tiselius e Kabat, nel 1939: gli Ab sono presenti nella frazione
Gamma-globulinica delle proteine sieriche
Structure of an antibody molecule. A. Schematic diagram of a secreted IgG molecule. The antigen-binding sites are formed
by the juxtaposition of variable light chain (VL) and variable heavy chain (VH) domains. The heavy chain C regions end in tail
pieces. The locations of complement- and Fc receptor-binding sites within the heavy chain constant regions are
approximations. B. Schematic diagram of a membrane-bound IgM molecule on the surface of a B lymphocyte. The IgM
molecule has one more heavy chain C region (CH) domain than IgG, and the membrane form of the antibody has C-terminal
transmembrane and cytoplasmic portions that anchor the molecule in the plasma membrane. C. Structure of a human IgG
molecule as revealed by x-ray crystallography. In this ribbon diagram of a secreted IgG molecule, the heavy chains are
colored blue and red, and the light chains are colored green; carbohydrates are shown in gray. (Courtesy of Dr. Alex
McPherson, University of California, Irvine.)
STRUTTURA FONDAMENTALE DI UNA
MOLECOLA DI IMMUNOGLOBULINA:
• catene PESANTI
• catene LEGGERE
due catene
leggere
(isotipo k o )
due catene
pesanti (isotipo 
oppure , , , )
ponti disolfuro che
legano tra loro le due
catene pesanti e
ciascuna catena
leggera ad una catena
pesante
REGIONI COSTANTI E REGIONI VARIABILI
regioni
VARIABILI
VH
CH1
VL
CL
regioni
COSTANTI
CH2
CH3
STRUTTURA FONDAMENTALE DI
UNA MOLECOLA DI
IMMUNOGLOBULINA
VH
CH1
catena leggera:
-1 dominio variabile VL
-1 dominio costante CL
catena pesante:
1 dominio variabile VH
3 o 4 domini costanti CH, a
seconda dell'isotipo
VL
CL
CH2
CH3
Struttura molecolare degli anticorpi:
Il “DOMINIO IMMUNOGLOBULINICO”è costituito da
un sandwich di foglietti planari , ciascuno dei quali
formato da nastri aminoacidici in configurazione
-antiparallela, collegati tra loro da anse di varia lunghezza.
DOMINIO IMMUNOGLOBULINICO
Structure of an antibody light chain. The secondary and tertiary structures of a human Ig light chain are shown
schematically. The variable (V) and constant (C) regions each independently fold into Ig domains. Each domain is
composed of two antiparallel arrays of b-strands represented by the flat arrows, colored yellow and red, respectively, to form
two b-pleated sheets. In the C domain, there are three and four b-strands in the two sheets. In the V domain, which is about
16 amino acid residues longer than the C domain, the two sheets are composed of five and four strands. The dark blue bars
are intrachain disulfide bonds, and the numbers indicate the positions of amino acid residues counting from the amino (N)
terminus. These Ig C and V domain structures are found in the extracellular portions of many other membrane proteins in
the immune system,
Structure of an antibody light chain. The secondary and tertiary structures of a human Ig light chain are shown
schematically. The variable (V) and constant (C) regions each independently fold into Ig domains. Each domain is
composed of two antiparallel arrays of b-strands represented by the flat arrows, colored yellow and red, respectively, to form
two b-pleated sheets. In the C domain, there are three and four b-strands in the two sheets. In the V domain, which is about
16 amino acid residues longer than the C domain, the two sheets are composed of five and four strands. The dark blue bars
are intrachain disulfide bonds, and the numbers indicate the positions of amino acid residues counting from the amino (N)
terminus. These Ig C and V domain structures are found in the extracellular portions of many other membrane proteins in
the immune system,
Hypervariable regions in Ig molecules. A. Kabat-Wu plot of amino acid variability in Ig molecules. The histograms
depict the extent of variability defined as the number of differences in each amino acid residue among various
independently sequenced Ig light chains, plotted against amino acid residue number, measured from the amino terminus.
This method of analysis, developed by Elvin Kabat and Tai Te Wu, indicates that the most variable residues are clustered
in three "hypervariable" regions, colored in blue, yellow, and red corresponding to CDR1, CDR2, and CDR3, respectively.
Three hypervariable regions are also present in heavy chains. B. Three-dimensional view of the hypervariable CDR loops
in a light chain variable (V) domain. The V region of a light chain is shown with CDR1, CDR2, and CDR3 loops, colored in
blue, yellow, and red, respectively. These loops correspond to the hypervariable regions in the variability plot in A. Heavy
chain hypervariable regions (not shown) are also located in three loops, and all six loops are juxtaposed in the antibody
molecule to form the antigen-binding surface (see Fig. 3-4).
Frammento Fab di un anticorpo complessato con un antigene,
legato a livello delle anse ipervariabili.
Binding of an antigen by an antibody. This model of a globular protein antigen (chicken lysozyme)
bound to an antibody molecule shows how the antigen-binding site can accommodate soluble
macromolecules in their native (folded) conformation. The heavy chains of the antibody are colored
red and the light chains are yellow, and the antigen is colored blue. (Courtesy of Dr. Dan Vaughn,
Cold Spring Harbor Laboratory.)
I siti combinatori per l’antigene comprendono regioni dette
“ipervariabili” dette CDR (Complementarity Determining
Regions), dove è concentrata la maggior parte delle differenze
di sequenza tra le diverse molecole di anticorpo.
La regione cerniera permette flessibilità
alle molecole anticorpali
La digestione delle IgG
con papaina o pepsina
(Porter 1962), ha
permesso di costruire
un modello di
struttura delle Ig, perché
a determinati frammenti
proteolitici corrispondono
Ffunzioni ben definite
Proteolytic fragments of an IgG molecule. IgG
molecules are cleaved by the enzymes papain (A)
and pepsin (B) at the sites indicated by arrows.
Papain digestion allows separation of two antigenbinding regions (the Fab fragments) from the
portion of the IgG molecule that binds to
complement and Fc receptors (the Fc fragment).
Pepsin generates a single bivalent antigenbinding fragment, F(ab¢)2.
DEFINIZIONI
• Antigene=sostanza che lega in modo specifico
Ig o TCR
• Immunogeno= antigene che innesca una rispost
aimmunitaria
• L’aptene, che e’ l’antigene, per esser
eimmunogeno deve essere caricato su di un
carrier (macromolecola)
• L’epitopo e’ la parte della macromolecola che
lega l’Ab
• Multivalente= molecola che presenta piu’ epitopi
The nature of antigenic determinants. Antigenic determinants (shown in orange, red, and blue) may
depend on protein folding (conformation) as well as on covalent structure. Some determinants are
accessible in native proteins and are lost on denaturation (A), whereas others are exposed only on
protein unfolding (B). Neodeterminants arise from covalent modifications such as peptide bond
cleavage (C).
Linfociti B: il recettore per l’antigene immunoglobulinico (Ig):
• forma di membrana (BCR)
• secreto (anticorpo)
Le Ig di membrana sono associate al complesso IgIg,
implicato nella trasduzione del segnale
Membrane and secreted forms of Ig
heavy chains. The membrane forms of
the Ig heavy chains, but not the secreted
forms, contain transmembrane regions
made up of hydrophobic amino acid
residues and cytoplasmic domains that
differ significantly among the different
isotypes. The cytoplasmic portion of the
membrane form of the m chain contains
only 3 residues, whereas the g3
cytoplasmic region contains 28 residues.
The secreted forms of the antibodies end
in C-terminal tail pieces, which also differ
among isotypes: m has a long tail piece
(21 residues) that is involved in pentamer
formation, whereas g3 has only a short
tail piece (3 residues). In this figure, the
m and g3 chains are compared, but other
g isotype heavy chains have structures
similar to g3. Amino acids are shown in
the letter code, and the last amino acid of
the terminal C region domain (i.e., Cm4
or Cg3) is indicated.
…è il tratto che le àncora
alla membrana cellulare
Changes in antibody structure during humoral immune responses. The illustration depicts the changes in the
structure of antibodies that may be produced by the progeny of activated B cells (one clone) and the related changes in
function. During affinity maturation, mutations in the variable (V) region (indicated by red dots) lead to changes in fine
specificity without changes in constant (C) region-dependent effector functions. Activated B cells may shift production
from largely membrane-bound antibodies containing transmembrane and cytoplasmic regions to secreted antibodies.
Secreted antibodies may or may not show V gene mutations (i.e., secretion of antibodies occurs before and after affinity
maturation). In isotype switching, the C regions change (indicated by color change from blue to orange) without changes
in the antigen-binding V region. Isotype switching is seen in membrane-bound and secreted antibodies.
• In base alla struttura delle regioni C della
catena pesante si differenziano 5 classi
(isotipi):
• IgA
• IgD
• IgE
• IgG
• IgM
I CINQUE
ISOTIPI (O
CLASSI)
DELLE
IMMUNOGLOBULINE
CH1
CH1
CH2
CH2
CH3
CH3
CH4
IgM
nella forma di
membrana
IgD
CH1
CH1
CH2
CH3
IgG
CH1
CH2
CH2
CH3
CH3
CH4
IgE
IgA
Il passaggio da Ig di membrana a Ig di secrezione dipende da
meccanismi di SPLICING ALTERNATIVO
I linfociti B maturi naive esprimono due tipi di recettore sulla
superficie : IgM e IgD. La catena leggera e’ la stessa. Nel trascritto
secondario l’esone VDJ viene associato alternativamente agli esoni di
C o C, per SPLICING ALTERNATIVO.
Isotipi immunoglobulinici in forma secreta
Schema delle 4 sottoclassi Ig umane
Le Ig di membrana presentano un tratto
carbossiterminale più lungo rispetto a quelle secrete…
Valency and avidity of antibody-antigen interactions. Monovalent antigens, or epitopes spaced far apart on cell
surfaces, will interact with a single binding site of one antibody molecule. Although the affinity of this interaction may be
high, the overall avidity is relatively low. When repeated determinants on a cell surface are close enough, both the
antigen-binding sites of a single IgG molecule can bind, leading to a higher avidity bivalent interaction. The hinge region
of the IgG molecule accommodates the shape change needed for simultaneous engagement of both binding sites. IgM
molecules have 10 identical antigen-binding sites that can theoretically bind simultaneously with 10 repeating
determinants on a cell surface, resulting in a polyvalent, very high avidity interaction.
Immagini al microscopio elettronico
a scansione di IgM e IgA in forma secreta
IgM
IgA
Antigen-antibody complexes. The sizes of antigen-antibody (immune) complexes are a function of relative
concentrations of antigen and antibody. Large complexes are formed at concentrations of multivalent antigens and
antibodies that are termed the zone of equivalence; the complexes are smaller in relative antigen or antibody excess
Importante nelle reazioni di immunoprecipitazione e titolazione
Come si misurano
• Facendo un titolo anticorpale ossia
vedendo la diluizione minima in cui non si
vede piu’ la formazione antigene anticorpo
(molto anticorpo= alto titolo).
PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI