Principi di Oncologia
Sperimentale
METASTASI SPERIMENTALI
RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO
IN VIVO
5° S. Beninati
Modelli sperimentali in vivo
• Permettono di valutare due parametri:
• proliferazione
• Colonizzazione/invasione
IL MODELLO ANIMALE
• SONO UTILIZZATI DIVERSI MODELLI ANIMALI PER
RIPRODURRE IL PROCESSO METASTATICO E LA
SUCCESSIVA INVASIONE E COLONIZZAZIONE DELL’ORGANO
BERSAGLIO
• I MODELLI CHE SI USANO COMUNEMENTE PERMETTONO DI
INOCULARE CELLULE TUMORALI DIRETTAMENTE
NELL’ANIMALE IN DIVERSE PARTI DEL CORPO:
• INTRAMUSCOLO
• INTRAPERITONEALE
• INTRAOCULARE
INTRASPLENICA
ENDOVENA
SOTTOCUTANEA
Parametri:
Volume,Peso,Aspetto,
angiogenesi, necrosi
Tumore primario indotto con inoculo
intramuscolare di cellule di melanoma murino
MODELLI ANIMALE DI MELANOMA
• Due modelli animali sono utilizzati per lo
studio del melanoma:
• Il modello polmonare
• Il modello splenico
Animali
• I topi del ceppo C57BL/6 sono utili se si
usano linee cellulari di melanoma murino
(B16-F10;B16-FLr6)
• Utilizzando topi singenici, cioè dai quali
sono state ottenute le linee tumorali, è
ridotto drasticamente il fenomeno del
rigetto.
•
*individui della stessa specie che sono geneticamente identici, per esempio animali
dello stesso ceppo consanguineo. Cellule proveniente da individui singenici possono
essere usate per modelli di trapianto d'organo e tumorali.
C57BL/6
Modello splenico
• Una sospensione di cellule di melanoma
viene iniettata direttamente nella milza
dell’animale.
• Le cellule di melanoma passano in circolo
e invadono il fegato.
• Le metastasi sono visibili poichè ricche di
melanina nera.
Modello Polmonare
• Le cellule di melanoma murino C57BL/6
sospese nel mezzo di coltura vengono
iniettate endovena nella vena caudale
dell’animale.
• Attraverso il circolo raggiungono un solo
organo bersaglio: il polmone
• Anche in questo caso le metastasi sono
visibili poiché ricche di melanina.
metastasi
Polmone di topo C57BL/6 invaso da
cellule tumorali di melanoma B16-F10
Valutazione del potere metastatico
• E’ possibile valutare il numero di metastasi
superficiale per mezzo di una conta visiva. Il
metodo risulta empirico e poco preciso in
particolare in presenza di un alto numero di
metastasi.
• E’ necessario considerare che l’organo bersaglio
è invaso anche nel suo stroma interno.
• Quindi la conta superficiale è sicuramente poco
significativa
Polmone di topo C57BL/6
invaso da metastasi di cellule
B16-F10
Polmone di topo C57BL/6
invaso da metastasi di
cellule B16-F10 trattato con
antineoplastici
Modello istologico di valutazione del
potere metastatico
• Per poter effettuare una conta delle
metastasi attendibile è necessario
considerare anche le metastasi interne.
• A tal fine l’organo bersaglio viene
sezionato in sottili fettine, per mezzo di un
microtomo.
• Il microtomo permette di ottenere fettini
sottilissime e trasparenti, denominate
“sezioni istologiche seriate”
Sezioni istologiche
seriate di polmone
di topo C57BL/6
inoculato con
cellule B16-F10
Analisi di immagine computerizzata
• Ogni singola sezione viene analizzata al
computer con un software adatto per la
misura di cinque parametri principali:
• 1. area della sezione istologica
• 2. area delle metastasi
• 3. numero di metastasi
• 4. area occupata dalle metastasi
• 5. percentuale di colonizzaione
Elaborazione morfometrica
• Il computer elabora i parametri precedenti
e il risultato permette di valutare:
• 1. area totale della sezione istologica (TA)
• 2. area media di una metastasi (AAMF)
• 3. area metastatica totale (TMA)
Invasione e proliferazione
• IL modello di calcolo nasce da due
considerazioni:
• La cellula tumorale invade l’organo
bersaglio e quindi inizia a proliferare.
• L’invasione può essere valutata
considerando il numero di metastasi
• Mentre la proliferazione valutando le
dimensioni delle metastasi
Elaborazione dei dati
• L’analizzatore di immagini permette quindi
di calcolare:
• L’area totale della sezione istologica TA
• L’area metastatica totale MTA
• L’area media di una metastasi AAMF.
• Attraverso questi parametri si ricavano tre
indici.
Indice di invasione
• Il rapporto
•
TMA/AAMF
• Si definisce Indice di Invasione o “Invasion
Index” (II)
•
•
•
II=TMA/AAMF
TMA= area metastatica totale
AAMF= area media di una metastasi
Invasione
• Infatti il rapporto TMA/AAMF definisce il
numero di metastasi totale, poiché deriva
da:
• TMA= area metastatica totale
• AAMF= area media di una metastasi
Indice di proliferazione
• Il rapporto
•
AAMF/TA
• Si definisce come indice di crescita o “Growth
Index” (GI)
•
•
•
GI=AAMF/TA
AAMF= area media di una metastasi
TA= area totale della sezione istologica
Indice di colonizzazione
• Il rapporto
•
TMA/TA x 100
• Esprime la percentuale di colonizzazione,
indicando quanta area è stata occupata
dalle metastasi. Si indica come %CI
•
•
TMA= area metastatica totale
TA= area totale della sezione istologica
Applicazione pratica
Due molecole con potenziale attività antineoplastica sono state saggiate e hanno
dato i seguenti indici:
Molecola
%CI (col. Index)
GI(growth index)
II (invasion index)
Controllo
33,6
110
30,6
Teofillina (TH)
7,9
90
7,5
Controllo
33,2
110
150,0
5,7
120
Βeta-teofillina (HET)
Colonizzazione
proliferazione
24,0
invasione
teofillina
•
Molecola
•
•
Controllo
Teofillina (TH)
%CI (col. Index)
33,6
7,9
GI(growth index)
II (invasion index)
110
90
30,6
7,5
•
•
% di:
•
La molecola risulta essere antimetastatica e poco antiproliferativa
-76,5%
colonizzazione
-18%
proliferazione
-75,5%
invasione
Beta-teofillina
•
Molecola
•
•
Controllo
Βeta-teofillina (HET)
•
•
% di:
•
La molecola risulta essere altamente antimetastatica e non influenza la
crescita tumorale
%CI (col. Index)
GI(growth index)
33,2
5,7
110
120
-82,8%
colonizzazione
0%
proliferazione
II (invasion index)
150,0
24,0
-84%
invasione
Confronto fra molecole
• E’ possibile comparare gli indici di varie
molecole potenzialmente antineoplastiche.
• In tal modo si può utilizzare un farmaco
mirato per il tipo di tumore.