Chimica Fisica Biologica
La caratterizzazione chimico-fisica
di proteine mediante
spettroscopia di dicroismo
circolare (CD)
Studio degli equilibri conformazionali (in
relazione all’attività biologica) della chaperonina
10 dal micobatterio della tubercolosi.
Gaetano M.M. Izzo
Intoduzione: Le chaperonine
Le proteine, per svolgere la propria funzione,
devono avere una
CONFORMAZIONE CORRETTA
MA…
Nell’ambiente cellulare esistono condizioni
che ostacolano il ripiegamento o che causano
la perdita della struttura proteica
Fattori che possono “disturbare”
il processo di ripiegamento di una
proteina nascente
Sintesi NON contemporanea di tutti i domini
della proteina
Presenza di grandi quantità di macromolecole
Esposizione di regioni idrofobiche o che si ripiegano lentamente
Instabilità delle proteine nell’ambiente cellulare
Denaturazioni e modificazioni
(ossidazioni, glicosilazioni…) spontanee
Esposizione ad agenti tossici ambientali:
radicali dell’O2, metalli pesanti, alcuni antibiotici…
Presenza di mutazioni che causano
l’assunzione di conformazioni anomale
Le cellule possiedono
meccanismi per prevenire
l’aggregazione proteica e per
ripristinare le giuste
conformazioni 
le proteine "chaperone"
Funzioni principali delle
proteine “chaperone”
Impedire l’aggregazione e la precipitazione delle
catene proteiche con una conformazione alterata
o durante il processo di trasduzione
 Aiutare le catene polipeptidiche ad assumere una
conformazione corretta durante la sintesi proteica
o a riacquistarla dopo un evento che ne ha
alterato la struttura
 Ruolo nella degradazione delle proteine alterate
strutturalmente

Classi di proteine "chaperone"

Hsp 90 (Heat shock Protein, 90kDa)
 Hsp 70 (70 kDa)
 Hsp 60/Chaperonine (60 kDa)
 Hsp 40/Dna J (40 kDa)
 sHsp (small Heat shock Protein, 12-43kDa)
Chaperonine o Hsp 60
Eucarioti
Procarioti
Compartimento
cellulare
Gruppo I:
Hsp60
Gro-EL
Mitocondri
TF55, TF56,
Termosoma
Citosol,
nucleo
Gruppo II:
TRiC/ CCT
Struttura
Due anelli
eptamerici;
oligomeri
Anelli
octamerici o
nonamerici;
eteromeri
Le chaperonine

Facilitano il ripiegamento delle proteine
nascenti e si legano ai substrati che non
hanno una conformazione corretta per
evitarne l’aggregazione e la precipitazione
 Struttura a doppio anello. Ogni anello è
costituito da più subunità
 Suddivise in due gruppi in base alla presenza
(gruppo I) o all’assenza (gruppo II) di una cochaperonina
Chaperonine di gruppo
I:struttura

Richiedono la presenza di una co-chaperonina
Cavità centrale
Residui idrofobici
Dominio apicale
Dominio
intermedio
Dominio
Sito per il equatoriale
legame e l’idrolisi
dell’ATP
Subunità
Chaperonine di gruppo I:
meccanismo d’azione
 Legame
ai substrati aspecifico
Co-chaperonina
ATP
Proteina non
ripiegata
correttamente
Proteina che
si ripiega in un
ambiente
protetto
Chaperonine di gruppo
II:struttura


Non necessitano di co-chaperonine
40% di omologia con le chaperonine di
gruppo I
 Struttura costituita da due anelli octamerici o
nonamerici, che delimitano una cavità
centrale più grande di quella delle
chaperonine di gruppo I
 Subunità simili a quelle delle chaperonine di
gruppo I, ma con in più una protrusione
elicoidale, che svolge la funzione delle cochaperonine
Mycobacterium tuberculosis
Chaperonin 10 (Mt cpn10)
Le chaperonine nei diversi organismi
Le chaperonine cpn60 e cpn10 sono membri della
famiglia delle heat shock proteins. Sono altamente
conservate (40-50% identità) e sono coinvolte nel
folding di polipeptidi sintetizzati di fresco. Per
questa loro attività le cpn10 formano eptameri non
covalenti.
Mt cpn 10 come hcpn 10 sono in grado di
attraversare le membrane (secrezione all’esterno
della cellula) a differenza della cpn10 da E. Coli .
Superposition of C backbones of cpn10Mt heptamer (subunits A to G in red) and GroES(blue)
structures with residues 18 to 34 (cpn10Mt) and 16 to 32 (GroES) deleted. C atoms outside
the rms fit of 1.3 Å2 are in green. Stereo views are from the side (A) and top (B).
The cpn10Mt tetradecamer. (A) The
tetradecamer viewed along the twofold
NCS axis. (B) Sketch of the staggered
arrangement of subunits viewed down
the sevenfold NCS axis. (C)
Electrostatic potential from +2.5 kT/e
(blue) to -7.5 kT/e (red) of the
molecular surface of subunits D, M, G,
and J. The internal diameter at the rim
of the heptamer base (21 Å) is marked
by Tyr 73 side chains and at the
midsection (30 Å) by Glu 35 side
chains. Viewed along the twofold NCS
axis.
Altre attività della Mt cpn10 (1)

A differenza di altri membri della famiglia che sono scarsamente
immunogenici, la proteina cpn10 da Mt è uno degli antigeni
immunodominanti del batterio.

Individui sani ma positivi alla tubercolina hanno elevate dosi di anticorpi
anti Mt cpn10 e linee cellulari T ottenute da questi individui reagiscono
selettivamente ed in maniera pronunciata alla proteina cpn10. Questo ha
indotto vari ricercatori ad identificare nella proteina un antigene
protettivo nei confronti dell’infezione da Mt.

A differenza di altri membri, la cpn10 da Mt è attivamente secreta dal
batterio sia durante la replicazione in vitro sia all’interno di macrofagi
infettati con Mt.
Considerando che la secrezione comporta uno spostamento dal
citosol della cellula, alla membrana e poi attraverso di essa, durante il
cui tragitto la proteina si trova in ambienti di differente natura, è
legittimo pensare che ciò sia accompagnato da cambi
struttural/conformazionali e che vi sia un processo di dissociazione
man mano che ci si avvicina alla membrana.
Altre attività della Mt cpn10 (2)

Forme ricombinanti della proteina hanno effetti farmacologici. Ad es.
immunizzazione con la proteina protegge ratti dallo sviluppo di artrite da
adiuvante, una forma sperimentale di artrite indotta con preparazioni
microbiali, oppure da forme sperimentali di encefalomielite. Inoltre,
l’immunizzazione con la proteina protegge cavie dallo sviluppo di
aftaepizootica (malattia virale di ovini, bovini, suini).

In vitro, sia il lisato di Mt che la proteina inducono riassorbimento
osseo (degradazione ossea). Questa reazione è bloccata dall’uso di
anticorpi anti-proteina, ciò indica che Mt ed in particolare la cpn10 sono le
probabili cause della cosidetta tubercolosi ossea che riguarda 1-2% dei
pazienti tubercolotici.

In vitro la proteina induce apoptosi e/o proliferazione delle cellule
linfocitarie facendo pensare che questo è un meccanismo attraverso cui si
esplica la sua attività in vivo.
Le ultime due attività si ottengono a dosi molto basse di proteina (circa nM).
Tutte queste attività sono difficilmente
riconducibili ad una specie strutturale
unica come l’eptamero.
In
particolare,
poiché
a
basse
concentrazioni la proteina si dissocia è
probabile che le ultime due attività siano
dovute al monomero.
Necessità di caratterizzare il monomero!!!
Caratterizzazione del monomero
Principali obiettivi:

Confermare la secrezione di Mt cpn10 dal Mt,
ma non per la GroES (cpn10 da E.Coli).

Studiare le preferenze strutturali di Mt cpn10
in condizioni simili a quelle in cui la proteina
si trova quando si avvicina all’interfaccia
ambiente acquoso/strato lipidico o quando
attraversa il doppio strato lipidico idrofobico
della membrana cellulare.

Comprendere se ci sono relazioni tra queste
strutture e la secrezione di Mt cpn10.
Studi CD in presenza di solventi
organici
Al fine di studiare l’attraversamento della membrana cellulare
da parte del monomero, sono state effettuate misure CD di
soluzioni acquose diluite di proteina, in tampone fosfato 50mM,
aggiungendo altri solventi alla soluzione, quali MeOH, TFE (e
AcCN), ed aumentandone via via la concentrazione.
In questo modo si diminuisce la polarità e quindi la costante
dielettrica del solvente e si mima l’effetto del cambio di polarità
del mezzo in cui si trova la proteina sulla sua struttura, cosi’
come avviene nella cellula quando la cpn10 prima si avvicina
alla membrana e poi ne attraversa il doppio strato lipidico.
Si evidenziano quindi mediante CD, i cambiamenti della
struttura del monomero che avvengono a livello di struttura
secondaria.
Mt cpn 10 e’ costituita da 99 residui aa con un PM di 10673 Da.
Spettri CD di Mt cpn10 in presenza di concentrazioni crescenti di MeOH (A) e di TFE (B).
In assenza di solvente organico, lo
spettro CD nel lontano UV è caratterizzato
da una intensa ellitticità negativa a 199200nm che corrisponde alla struttura
random coil e da una ampia spalla nella
regione della struttura secondaria tra 215 e
235nm. All’aumentare della % di MeOH,
si ha una progressiva diminuzione di
intensità negativa a 199nm, ed essa si
sposta a l più alte, e si ha un incremento
di intensità del segnale nella regione di
struttura secondaria. Al 70% di MeOH, lo
spettro mostra un tipico profilo ad a-elica,
con ellitticità a 206 e 222nm e non si
modifica più con aggiunta di ulteriore
MeOH. Dalla deconvoluzione di questo
spettro si evidenzia che circa il 25% dei
residui aa sono in a-elica ed il 22 in bsheet.
Questi risultati indicano che il monomero
forma conformazioni contenenti eliche in
condizioni di ridotta polarità del
solvente.
I solventi organici sono stati aggiunti ad una soluzione di
proteina in KH2PO4, pH7.4. La conc. di KH2PO4 è 50mM e la
conc. di proteina è tenuta a 4mM.
Poichè in uno studio precedente si era visto che Mt cpn10 ad una conc. 9.3mM in 65%MeOH,
mostrava uno spettro CD tipico di un b-sheet, con un unico minimo di 218nm e ciò sembra in
contrasto con la conformazione parzialmente ad elica vista nel nostro caso in condizioni simili, per
comprendere quali sono le ragioni di questa differenza, è necessario fare spettri CD in una
soluzione acqua/MeOH, mantendone costante il rapporto, e variando la concentrazione di proteina.
Si vede così come la struttura di Mtcpn10 passa da una struttura parzialmente ad elica ad una
struttura prevalentemente b all’aumentare della concentrazione di proteina. La transizione è
netta ed avviene tra 9 e 18 uM. Da dati di spettrometria di massa per la soluzione 4mM di proteina
si ha il segnale del monomero con massa 10673 uma, mentre si ha una specie con massa
21345uma corrispondente ad un dimero si ha per concentrazione 40mM. Si ha la copresenza delle
due specie alle concentrazioni intermedie: la concentrazione di dimero aumenta all’aumentare della
concentrazione di proteina. Tutto ciò indica che la transizione da alfa a beta è accompagnata da
oligomerizzazione a dimero.
A
B
Dipendenza dalla concentrazione della struttura CD di Mt cpn10 in soluzioni acqua/MeOH (1:1 vol/vol).
(A) Spettri CD di Mt cpn10a tre diverse concentrazioni
(B) Dipendenza dalla concentrazione dell’elliticità molare a 204nm osservata in 100mM KH2PO4-MeOH (1:1 vol/vol) nel range di
concentrazioni da 2.4 a 24mM. Il punto medio della transizione è a 16mM.
Questa transizione (da a-elica a all-b)
è sotto controllo termodinamico come
dimostrato dal fatto che diminuendo la
temperatura di una soluzione contenente il
monomero parzialmente in a-elica da 25° a 4°C si induce un cambiamento conformazionale
a struttura prevalentemente b. La transizione è
reversibile, per cui riscaldando la soluzione a
37°C, viene parzialmente ripristinato il profilo ad
elica del monomero.
Sia riscaldando che raffreddando, gli spettri CD
alle diverse temperature, si intersecano in un
punto isodicroico a circa 211nm: questo indica
una transizione, un equilibrio tra due soli
componenti,
monomero
con
struttura
parzialmente a e dimero b-sheet.
Dipendenza dalla temperatura della struttura in soluzione di
Mt cpn10 (4uM) in 70% MeOH.
(A) Transizione strutturale da a-elica a all-b che avviene a
bassa temperatura.
(B) La struttura all-b lentamente si converte nuovamente
alla struttura ad a-elica quando la soluzione viene
mantenuta a 37°C per 240min.
Regioni con struttura ad a-elica
Per identificare le regioni del monomero che possono formare la struttura a-elica, sono
stati studiati peptidi sintetici troncati all’N-terminale in diverse miscele di solventi. Come
per la proteina intera, i peptidi 26-99 e 51-99 sono parzialmente ad elica in miscele contenenti
MeOH o TFE ed il loro contenuto in elica aumenta aumentando la concentrazione del
solvente organico. La deconvoluzione dello spettro in 70% MeOH assegna la struttura ad
elica a 11 residui per il 26-99 e 10 per il 51-99. Poiché nella proteina intera ci sono 25 aa
in struttura ad elica, si può concludere che una o più eliche si trovano nell’N-terminale.
-1
[] x 10 (deg.cm .dmol )
1000
2
500
40% MeOH
10% MeOH
50% MeOH
20% MeOH
60% MeOH
30% MeOH
70% MeOH
2
0% MeOH
-3
-1
[] x 10 (deg.cm .dmol )
1000
-3
0
-500
500
0% MeOH
50% MeOH
20% MeOH
70% MeOH
30% MeOH
0
B
-500
A
190
-1000
190
200
210
220
230
240
250
200
210
220
230
240
250
Wavenumber (nm)
Spettri CD dei peptidi sintetici (10uM) corrispondenti alle sequenze 26-99 (A) e 51-99 (B) di Mt cpn10, mostrano la
formazione di una struttura parzialmente ad elica per aggiunta di metanolo alle soluzioni di proteina in potassio
fosfato, pH7.4. La concentrazione della tampone fosfato in queste miscele è stata mantenuta a 50mM.
Per verificare se effettivamente l’N-terminale contiene a-eliche è stato studiato il
peptide corrispondente alla sequenza 1-25 di Mt cpn10 in miscele di solventi.
Nella sola soluzione buffer (tampone), la molecola ha principalmente una struttura
random coil ma acquisisce una struttura ad elica in MeOH-acqua (95:5, vol/vol).
Dallo spettroscopia NMR di questo peptide si vede che esso contiene una a-elica tra
i residui 1 e 16 e che essa è compatta tra i residui 6 e 16 ed è più ‘fragile’ all’Nterminale.
Spettri CD dei peptidi sintetici 1-15 e 1-25 di Mt cpn10 e 1-23 di E.Coli cpn10 in presenza di micelle SDS o in 166mM
KH2PO4-MeOH (0.3:0.7, vol/vol).
Le chaperonine 10 umana e da E. Coli
Poiché la hCpn10 è capace di attraversare le membrane biologiche (per entrare nel
mitocondrio), ma la cpn10 da E.Coli (GroES) non è capace di attraversare le membrane, lo
studio in diversi solventi può essere esteso a queste due cpn10 per verificare se esiste una
relazione tra la struttura e il loro diverso comportamento nella secrezione.
In soluzioni tampone diluite le due cpn10 (h e E.Coli) danno uno spettro analogo a quello
della Mt cpn10 con un picco attorno ai 200nm (random coil) e una minore intensità nella regione
della struttura secondaria. Per aggiunta di MeOH o TFE, lo spettro CD della hCpn10 cambia
verso una forma di tipo elica, mentre la GroES dà uno spettro a struttura all b. Lo spettro a
struttura all b della cpn10 da E.Coli è indipendente dalla concentrazione di proteina tra 0.1 e
2 uM e dalla temperatura tra -4° e 40°C. Come atteso e confermato dalla spettrometria di
massa, la GroES è una miscela di monomeri e dimeri. Cosi’ in presenza di solventi organici
e a temperatura ambiente, le cpn10 Mt e human sono monomeriche e parzialmente ad elica,
mentre la cpn10 da E.Coli è dimerica ed ha la struttura di una proteina b.
Spettri CD della cpn10 umana (2uM) in MeOH- o TFE- 100mM KH2PO4 (1:1 vol/vol) (A) e di E.Coli cpn10 (0.1uM)
in 166mM KH2PO4-MeOH (0.3:0.7, vol/vol) a 25° e 40°C (B).
Alcune informazioni da altre tecniche sperimentali
Per identificare le condizioni di concentrazione che favoriscono Mt cpn10 monomero, sono
stati effettuati studi di equilibri di sedimentazione in tampone fosfato a pH7.4. A 9.3mM il peso
molecolare medio è tra 20 e 30 kDa e ciò indica una AUTOASSOCIAZIONE in queste condizioni
(monomero a dimero e trimero). La dissociazione completa avviene a 4.7mM.
La dissociazione completa della proteina in soluzioni diluite viene confermata per SEC nel range di
concentrazione 18-0.9 uM. La proteina viene eluita come picco singolo a circa 23.4 min.
L’incremento del tempo di ritenzione in modo progressivo con la diluizione indica la
dissociazione in specie più piccole. A 4.7mM il tempo di ritenzione è 23.8 min e non varia più per
ulteriore diluizione, in accordo con la completa dissociazione a monomero.
Dipendenza dalla concentrazione di proteina del
tempo di ritenzione di MtCpn10 misurata
per HPLC/SEC in 50mM KH2PO4, pH7.4 nel range
di conc. 0.9-18uM.
Dai risultati visti si può pensare che la struttura in soluzione del monomero può essere descritta
come un equilibrio tra conformeri parzialmente ‘foldati’ e completamente ‘random’.Gli equilibri
conformazionali possono essere perturbati da cambiamenti nella composizione del solvente (es. solventi
di diversa polarità) o delle condizioni della soluzione e questo può portare alla formazione ed accumulo
preferenziale di uno o più conformeri. Si sono quindi studiate soluzioni diluite di Mtcpn10 in diverse
condizioni di pH, T e composizione del solvente.
L’effetto del pH è stato studiato nell’intervallo 7.4-1.9. Al di sotto di 7.4 l’ellitticità a 200nm diminuisce e si
sposta a l più elevate. Tra 5.8 e 2.9, gli spettri sono sovrapponibili e simili a quelli della Mt cpn10
oligomerica con un minimo a circa 204nm ed una ampia banda nella regione di struttura secondaria. A
pH1.5 l’ellitticità ritorna a 200nm suggerendo una denaturazione acido-indotta. E’ da notare tuttavia che
lo spettro CD a questo pH ha un piccolo ma significante contributo di struttura secondaria tendente alla
regione dell’elica (>220nm). La forma degli spettri nell’intervallo 5.8-2.9 suggerisce che il monomero si
auto-associa in queste condizioni. Ciò e’ confermato da esperimenti di sedimentazione i cui risultati
indicano la presenza in queste condizioni di specie oligomeriche. Quindi il monomero si autoassocia nel
range di pH 2.9-5.8 ed ha una composizione nella struttura secondaria (b-sheet e random coil) simile a
quella osservata per la Mt cpn10 oligomerica a pH neutro.
Spettri CD nel lontano UV di una soluzione diluita di Mt
cpn10 (2.3uM) in 2.5 mM PO43- che mostrano la dipendenza
dal pH della struttura della proteina nel range pH 7.4-1.5
Dipendenza dalla temperatura degli spettri
CD di Mt cpn10 monomerica (2.3uM) in
2.5mM PO43-, pH7.4
A. Intervallo -7° - 24 °C
B. Intervallo +27°C - +56°C.
Sono stati effettuati altri esperimenti per vedere
l’influenza della temperatura sulla struttura
secondaria del monomero tra -7°e 56°C. Tutti i
cambiamenti spettrali sono reversibili.
Lo spettro del monomero non cambia quando la
temperatura varia tra -7 e 24°C e presenta la stessa
ellitticità negativa a 200nm ed una spalla a 218nm.
Tuttavia, scendendo al di sotto di 14°C, si ha un
progressivo incremento nell’ellitticità a 200nm
(random coil) ed in parallelo decresce la struttura
secondaria a 218nm. Questi cambiamenti strutturali
sono associati ad un punto isodicroico a 208nm,
che indica un equilibrio tra due componenti. Una
componente è la conformazione presente tra 14 e
24°C e l’altra è il monomero denaturato per
raffreddamento la cui formazione completa non
e’possibile osservare per il congelamento della
soluzione refrigerante sotto i -7°C.
A temperature sopra i 24°C si incrementa la
struttura random coil a 199nm. Per ulteriore
riscaldamento, la spalla a 218nm si sposta a
222nm. Al di sopra dei 56°C, non si hanno ulteriori
variazioni.
Dipendenza dalla temperatura dell’elliticità
molare 199/200nm e 222nm del monomero (A)
dell’eptamero (B) di Mt cpn10.
La temperatura di ‘fusione’ Tm di questa
transizione e’ 35.5°C(fig.A).
E’ noto che gli eptameri di cpn10
dissociano
a
monomeri
ad
alta
temperatura: per ulteriore verifica, sono
stati registrati spettri CD di eptamero
cpn10 a diversa temperatura (fig.B).
L’ellitticità a 222 nm aumenta con la
temperatura fino a 65°C. Al di sopra di
questa temperatura lo spettro non cambia.
La Tm di questa transizione è circa 48°C
e più elevata dei 35.5°C visti per il
monomero e ciò è in accordo con la
necessità di ulteriore energia per
dissociare l’eptamero nelle sue subunità
monomeriche.
Spettri CD nel lontano UV di Mt cpn10 in 100mM
fosfato- MeOH (1:1, vol/vol) a concentrazione
4.7uM e 19uM. L’incremento nella concentrazione
porta la proteina a cambiare conformazione da
parzialmene elica a all b e ciò é dovuto alle sue
dimensioni
A
Dipendenza dalla lunghezza della
proteina
dell’ellitticità molare a 222nm misurata sui peptidi
sintetici della proteina troncati all’N-terminale.
B
Struttura del peptide 1-25 (elica anfifilica) e modello dell’elica predetta per il peptide 84-99
Y85
B
A
K6
N17 D10 V3
D92
V14
L13
L86
A90
V93
V97
P7
K2
K11
E9
K99
N4
A16
I5
Q15
S89
I12 A1 L8
E83
R93
C
Secondary structure predictions
75 GTEIKYNGEEYLILSARDVLAVVSK 99
1)
---------AAAAAAAAAAAAAA-2)
--BB----AAAAAAAAAAAAAAAAA
3)
--------AAAAAAAAAAAA----A,a-helix
B,b-sheet
E84
Sequence homology
Mt cpn10 84 EYLILSARDVLAVVSK 99
|| •
• •|•
Leptin
11 KTLIKTIVTRINDISH 26
a-helix A
Mt cpn10 84 EYLILSARDVLAVVSK 99
• • ||•| •••
Leptin
77 ANDLENLRDLLHLLAF 92
a-helix C
Studio Mt Cpn10 a bassa conc.
Analisi dei risultati (1)
Dato sperimentale di tipo biologico
La proteina Mt Cpn10 non è presente solo nel citoplasma del micro-organismo, ma
è concentrata anche sulla superficie interna della cellula batterica, per cui essa è
capace di attraversare la parete cellulare della cellula.
Esperimento
La struttura in soluzione di Mt Cpn10 è stata studiata in condizioni di ridotta polarità del
solvente o in presenza di detergenti (dati non riportati) per capire quali sono i
cambiamenti strutturali che permettono alla proteina di interagire con i fosfolipidi della
membrana o di attraversare l’interno altamente idrofobico della membrana cellulare.
Risultati ottenuti
Mt Cpn10 è monomerica a basse conc. in miscele di solventi organici in cui forma
strutture stabili parzialmente ad elica (circa 25 residui). Una elica anfifilica si trova
nella regione 1-16 (studi sui peptidi e NMR) e una altra è predetta sulla base di
considerazioni sulla sequenza nella regione 83-99. Per cui il monomero contiene in
queste condizioni, due eliche, una al C e l’altra all’N terminale. Ciò è in contrasto con la
struttura cristallina dell’eptamero (b). Dagli studi effettuati si evidenzia una transizione da
b-strand ad a-elica, l’elica si stabilizza aumentando l’idrofobicità o l’acidità dell’ambiente.
Il monomero con struttura parzialmente ad elica è in equilibrio con un dimero della
proteina che ha struttura b. L’associazione a dimero è un processo reversibile
favorito dall’aumento di conc. della proteina e dall’abbassamento di temperatura.
(E Coli rimane b).
Studio Mt Cpn10 a bassa conc.
Analisi dei risultati (2)
__________________________________________________________________
Osservazione sperimentale
A pH neutro e al di sotto di 4.7mM, in assenza di cationi divalenti, la
proteina si dissocia a monomero.
Interpretazione
Ciò può essere spiegato considerando l’elevato numero di cariche negative
presenti nell’ ‘orifice dome’ dell’eptamero (nell’E.Coli ce ne sono molte
meno, circa la metà), fatto confermato dalla capacità del monomero di
autoassociarsi a dimero a pH acidi, dove i gruppi carbossilici vengono
neutralizzati.
__________________________________________________________________
Osservazione sperimentale
Il monomero con il C-terminale con struttura b è stabile in un range di
temperatura molto stretto, 14-24°C, al di sotto di 14°C si ha denaturazione.
Interpretazione
Ciò è dovuto alle interazioni tra l’acqua ed i gruppi non polari che diventano
esposti nella proteina non foldata. Tali gruppi sono molto più abbondanti nelle
cpn che in altre proteine globulari.
Studio Mt Cpn10 a bassa conc.
Analisi dei risultati (3)
Ulteriori dati sperimentali dagli studi di temperatura
Al di sopra di 24°C il monomero ha un secondo stadio di unfolding che non porta
alla completa denaturazione. La Tm di questa transizione e della dissociazione
termica dell’eptamero sono molto più basse che per hCpn10 e E.Coli Cpn10 e
ciò indica una minore stabilità dell’oligomero. Ad alte temperature o in condizioni
fortemente acide, Mt Cpn10 monomero non è completamente denaturato e
contiene residui in struttura ad elica.
Altri dati biologici che possono essere spiegati da questi risultati
La struttura parzialmente ad elica può essere importante non solo nel
trasporto della proteina all’esterno del batterio, ma può essere anche
coinvolta in altre attività biologiche come il riassorbimento osseo, poiché
esse avvengono a 37°C dove la transizione da beta ad alfa è già avvenuta.
Equilibri che coinvolgono le diverse strutture di Mt Cpn10
identificate.
Hep + Tet + Tri + Dim
C > 4.7 mM
[Mg2+] < 2mM
Heptamer
Small oligomers
(average MW, 18 kDa)
C  0.1 mM
[Mg2+]  2 mM
C < 0.9 mM
6.5  pH  1.9
C
N
T < 14° C
Dilute Aqueous Solution
Negatively charged
detergents
Organic solvents
C < 10 mM
Organic solvents
C > 10 mM
____
++++
N
Partially helical
monomer
All-b dimer