Incontri di Fisica 2009
EFFETTI BIOLOGICI
DELLE
RADIAZIONI IONIZZANTI
Ubaldo Bottigli
Università di Siena
&
Sezione INFN di Pisa
[email protected]
LNF 7-9 Ottobre 2009
CSN5 – Fisica Applicata
Ricerche Tecnologiche di avanguardia
mirate ai temi scientifici ed agli esperimenti dell’INFN
• I progetti finanziati dalla CNS5 si collocano nel campo
della strumentazione dedicata agli esperimenti di
fisica nucleare, sub-nucleare ed astro-particellare:
 Rivelatori di particelle, sviluppi di elettronica e
software
 Acceleratori di particelle, sviluppi di elettronica e
software
 Applicazioni di tecniche d’avanguardia nei settori
inter-disciplinari e delle scienze della vita
CSN5 – Fisica Applicata
La CSN5 esiste fin dalla nascita dell’INFN e quindi
ben prima della “attuale presunta richiesta
governativa di applicazione”.
I padri fondatori hanno pensato che una
Ottima
Buona
Sufficiente
Pessima
Ricerca Fondamentale
Ottima
Buona
Sufficiente
Pessima
Ricerca Applicata
Dose
La dose è l’energia assorbita per unità di massa:

E
D
Gy = J/Kg = m2/s2
1 Gy = 100 rad
m
Equivalente di dose
L’equivalente di dose è un fattore (wR) moltiplicativo che
indica il danno biologico relativo a parità di dose fisica:
H  DwR
Unità: Sievert, (Sv). Se wR = 1, allora 1 Gy = 1 Sv
Vecchie unità = 100 rem = 1 Sv
From ICRP n. 60 (1991)
Radiation
Radiation Weighting Factor (wR)
X and g rays, electrons(*)
Protons (E>2MeV)
Neutrons (energy dependent)
a particles and other multi-caharged
(*)w =1
R
1
5
5÷20
20
for electrons of all energies except for Auger electrons emitted by
nuclei bound to DNA
Meccanismo cellulare di base del danno da radiazione
Le
Le radiazioni
radiazioni
ionizzanti
ionizzanti
possono
producono i
danneggiare
danni sia
direttamente
direttamente,il
bersaglio
colpendo la
molecolare,
cellula, sia
oppure
indirettamente,
ionizzare
l’acqua
ionizzando
e quindi
produrre
l’acqua, la
radicali
quale
liberi
a sua che
volta,
aggrediscono
genera dei a
loro
radicali
voltaliberi
le
molecole.
che attaccano il
bersaglio
cellulare.
Modelli di sopravvivenza cellulare
Un grafico della
frazione di
sopravvivenza vs la
dose, mostra due tipi
di meccanismo di
danneggiamento: il
tipo-A (curva
tratteggiata) ed il
tipo-B (curva intera).
Psurvival  e
aD  D 2
Meccanismo cellulare di base del danno da radiazione
Le radiazioni
ionizzanti
possono
danneggiare
direttamente il
bersaglio
molecolare,
oppure ionizzare
l’acqua e quindi
produrre radicali
liberi che
aggrediscono a
loro volta le
molecole.
Effetti sulla molecola del DNA
• La irradiazione può produrre vari tipi di alterazioni
nella struttura della molecola del DNA per effetto
diretto o indiretto
– alterazioni delle basi pirimidiniche (T , C ) o
puriniche (A , G )
– alterazioni del desossiribosio
– rottura di legami con distacco di frammenti e
formazione di nuovi legami nello stesso filamento
o crociati
– rottura di un singolo filamento dell’elica (Single
Strand Break)
– rottura di entrambi i filamenti (Double Strand
Break) per effetto di una singola traccia o di due
tracce contemporanee (hot spots)
Effetti del danno del DNA (End-point biologici)
•
Riparazione completa con restitutio
– avviene per la grande maggioranza delle alterazioni minori
– la cellula riprende la sua normale attività
•
Riparazione erronea (misrepair)
– la cellula muore dopo alcune divisioni (morte mitotica ritardata)
– la cellula muore senza dividersi per accelerazione della morte
programmata (apoptosi)
– la cellula non muore ma presenta mutazioni che possono modificare
alcune funzioni
•
Fissazione non riparabile del danno
– la cellula muore subito nel giro di ore per liberazione di enzimi litici
indipendentemente dalla mitosi (morte interfasica); riguarda alcune
specie cellulari specifiche (linfociti, ovociti, cell. salivari sierose)
– la cellula muore in occasione del primo evento mitotico (morte
mitotica) o dopo alcune mitosi (morte mitotica ritardata)
Il danno non riparabile è sostanzialmente
rappresentato dalle doppie rotture (DSB)
La risposta delle cellule dipende…
1.dal rate di dose
2.dal tipo di cellula
3.dalla fase del ciclo cellulare
4.dalla presenza dell’ossigeno
Come se non bastasse…….la Dosimetria
Gli effetti biologici delle radiazioni ionizzanti
dipendono, come abbiamo visto, da molteplici
fattori fisici e biologici e riguardo a quest’ultimi
possiamo individuare tre bersagli interessanti:
la cellula
l’organo
l’organismo
Non è immediata la generalizzazione dei
risultati ottenuti su di un bersaglio rispetto
agli altri.
Il problema delle basse dosi
Dosi non letali
dal cGy al Gy in funzione del
bersaglio
Il problema delle basse dosi
Negli Stati Uniti sono state eseguite 62 milioni di Tac nel 2006, contro i tre
milioni del 1980 [the New England Journal of Medicine (NEJM) Nov. 2007]
Il problema delle basse dosi
Il problema delle basse dosi
F
Forum
europeo (2010-2025) sul
o
r
problema
degli effetti sulla
u
m
popolazione delle dosi dovute ad
esami di imaging biomedico.
Presidenza italiana del forum
ISS
Un Programma di lavoro
Studio degli effetti biologici indotti
a seguito di esposizione a basse
dosi di radiazioni ionizzanti
Comprensione
degli effetti
non-lineari
Contributo
alla
valutazione
del rischio
EXCALIBUR
(EXposure effeCts At Low-doses of Ionizingradiation in Biological cultURes)
BO
CA/SS
LNF
LNGS
LNL
PV
PI/SI
Roma3
Dose dall’ambiente
Equivalente di dose annuale media è ~3 mSv
G. Moschini, G. Pavarin, M. Pelliccioni, E. Righi
Dose media per
irraggiamento
esterno (mSv/y)
da fondo naturale
Esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti
Principali sorgenti naturali “Terrestri” e loro
vite medie
Contributo delle
varie sorgenti
naturali di radiazioni
ionizzanti alla dose
annuale media
all’uomo negli
U.S.A.
Potassio-40
40K
1.3x109a
Rudio-87
87Rb
5x1010a
Torio-232
232Th
1.4x1010a
Uranio-238
238U
4.5x1010a
Contributo alla dose media annuale delle
principali sorgenti di irraggiamento interno
Contributo relativo
delle varie sorgenti di
radiazioni ionizzanti
alla dose annuale
media all’uomo nel
mondo.
22
F.A. Mettler et al, 1995
Potassio-40
40K
17 mrem/a
Carbonio-14
14C
10mrem/a
Polonio-210
sino a Piombo210
210Po
Totale
210Pb
12 mrem/a
39mrem/a
S.C. Bushong, 1998
Valutazione di rischio alle basse dosi
•
Studi a dosi medio-alte:
- studi in vitro: irraggiamenti a “fascio
largo”
- studi epidemiologici: sopravvissuti di
Hiroshima e Nagasaki, minatori di uranio,
Chernobyl, popolazione medicalmente
esposta
?
+ Estrapolazione alle basse dosi
 assunzione cautelativa in
radioprotezione: andamento lineare
alle basse dosi
(E.J. Hall, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 65, No. 1, pp. 1–7, 2006)
•
Studi epidemiologici diretti a basse dosi
- misura dell’esposizione indoor di radon e correlazione con l’incidenza di cancro ai polmoni
 problemi metodologici nella determinazione dell’esposizione dell’individuo
Obiettivi
Studio degli effetti biologici indotti a seguito di esposizione a
basse dosi di radiazioni ionizzanti, con particolare riguardo agli effetti “nonlineari” (ipersensibilità, radioresistenza indotta, risposta adattativa, effetti
di bystander..)
1. Studio dei meccanismi di induzione e trasmissione del danno a basse dosi
di radiazioni, in colture cellulari, in funzione della qualità della radiazione
(raggi γ/X; protoni, alfa e ioni pesanti di varie energie)
2. Studio dell’influenza dello stato di crioconservazione sulla risposta
cellulare alle radiazioni ionizzanti (raggi γ) di sistemi biologici in-vitro e invivo, esposti al fondo naturale di radiazioni.
3. Contributo alla valutazione di rischio per esposizioni alle basse dosi di
R.I.
4. Sistematica di effetti biologici indotti in diversi sistemi cellulari di
mammifero, in coltura o crio-conservati, in funzione della qualità della
radiazione e della dose(nel regime delle basse dosi), inclusi sistemi “in-vivo”
(embrioni di pecora)
Stato dell’arte (1)
Per esposizioni alle basse dosi di R.I. (<0.5 Gy) in
radioprotezione, in via cautelativa, la valutazione di rischio è
effettuata estrapolando i dati delle alte dosi, mediante una
relazione “lineare senza soglia” (LNT, Linear No-Threshold
cancer risk model), con l’assunzione “a prioristica” che gli
organismi viventi rispondano allo stesso modo alle basse come
alle alte dosi.
In effetti, evidenze sperimentali accumulate negli ultimi 15 anni
hanno mostrato la presenza di effetti “non-lineari” specifici alle
basse dosi, non riscontrati alle alte dosi, quali:
•l’ipersensibilità e la radioresistenza indotta (HRS/IRR);
•l’effetto bystander (BE);
•l’instabilità genomica.
Stato dell’arte (2)
Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (HRS/IRR)
Fenomeni di ipersensibilità e radioresistenza indotta
sono stati riscontrati in più di 40 linee cellulari in vitro
(umane, normali e tumorali, e di roditore), in seguito a
irraggiamenti con basse dosi di radiazioni di raggi X/g.
In esperimenti di sopravvivenza cellulare, tali effetti
si traducono in una deviazione per dosi < 1 Gy dal
convenzionale andamento lineare o lineare-quadratico
delle curve dose-risposta, con una mortalità maggiore
(HRS) alle dosi più basse e radioresistenza (IRR)
successiva al crescere delle dosi.
Effetti delle basse dosi:
Ipersensibilità (HRS) e Radioresistenza indotta (IRR)
(Marples and Joiner,Int. J. Radiat. Biol. 2001, vol. 77, 1133-1139)
Irraggiamenti cellulari con RX:
• Cellule normali e tumorali di ≠ radiosensibilità
• Iper-sensibilità alle basse dosi
• Radioresistenza indotta
Meccanismo protettivo indotto da basse
dosi di radiazioni
Con neutroni e pioni di alto LET:
Andamento lineare (no HRS/IRR)
Stato dell’arte (3)
Ipersensibilità e Radioresistenza indotta
(HRS/IRR)
Più recentemente HRS/IRR sono stati
osservati anche con radiazioni densamente
ionizzanti (ioni pesanti) in cellule di
roditore, in contrasto però con quanto
osservato con neutroni, pioni nel picco di
Bragg e protoni di alta e bassa energia.
… Effetti delle basse dosi:
Ipersensibilità e Radioresistenza indotta
(E.Tsoulou et al., Int. J. Rad. Biol. (2001),vol. 77, 1133-1139)
at LNL: broad ion beam cell irradiations:
• 60Co grays and 4He2+ ions
of different energies
(59, 79 and 102 keV/mm LET)
• Chinese hamster V79 cells
•
•
Iper-sensibilità alle basse dosi (HRS)
Radioresistenza indotta (IRR)
delle basse dosi
Effetto “Lazzaro” …Effetti
(studi in vitro)
G. Borhnsen et al., Radiat. Prot. Dos.(2001),vol. 99, 255-256
Tsoulou,..,Cherubini et al., Radiat. Prot. Dosim. 99(2002) 237-240
GSI SIS facilty scanned pencil beam
and LNL broad ion beam cell
irradiations:
• 6MV photons and 12C6+ ions of 92.5
MeV/amu on target (27.5 keV/mm
LET)
• 60Co grays and 4He2+ ions
of different energies
(59, 79 and 102 keV/mm LET)
• Chinese hamster V79 cells
•
•
Low dose
hyper-radiosensitivity
Induced radioresistance
Stato dell’arte (4)
Effetto bystander (BE)
In esperimenti in vitro è stato osservato che il danno da
radiazione è espresso anche in cellule non direttamente
interessate dal deposito energetico, ma vicine (a contatto o
non) a cellule irradiate.
Tale effetto è stato riscontrato, in molte linee cellulari (di
roditore, umane normali e tumorali), per diversi end-point
biologici (scambi di cromatidi fratelli, aberrazioni cromosomiche,
micronuclei, apoptosi, morte clonogenica, trasformazioni
oncogeniche, mutazioni) e con diversi approcci sperimentali
(irraggiamenti con “micro fasci” di RX o ioni; irraggiamenti con
fasci “larghi” di ioni o con sorgenti con mascheramento di parte
della popolazione cellulare esposta; esperimenti di trasferimento
del terreno di coltura da una popolazione irraggiata a una non
irraggiata; esperimenti di co-cultura tra popolazione irraggiata
e non).
Effetti delle basse dosi: Bystander effect
By soluble molecules?
By gap-junction?
•
1 cellula colpita all’interno di una popolazione
•
Danno (morte cellulare, apoptosi, induzione di micronuclei, trasformazioni oncogeniche)
espresso in più di 1 cellula (..evidenze sperimentali..)
•
Quali meccanismi di induzione e trasmissione del danno?...
 secrezione di fattori citotossici nel mezzo di coltura da parte delle cellule irraggiate
 comunicazione diretta tra cellule attraverso “gap-junction” ….
 ROS/RNS (NO); ….
Radiazione
Mitocondrio
produce energia
(possiede il suo
DNA - mtDNA)
Interazione diretta (e- )
e indiretta (ROS)
Nucleo = sede
del materiale
Genetico (DNA)
Citoplasma
©SG2008
Citoplasma
N = Nucleo (  8 μm )
Modificato da L.E. Feinendegen,2005
Signaling between Tissue Cells and Matrix
Tissue
Gap
Junction
Cells
Matrix
= Bystander Effects
Ulteriore “Open problem”: Qual è il “target” della radiazione?
L.E. Feinendegen, 2005
Hit Cell
Riassunto effetti delle basse dosi
1) Priming dose: 5-40 cGy RX
qualche h prima dell’irraggiamento
2) Irraggiamento (Challenging dose)
Osservato:
 in vivo e in vitro (protozoi, alghe, cell
vegetali e di mammifero)
 per diverse linee cellulari
 per diversi end-point biologici (mutazioni,
trasformazioni oncog., micronuclei, danno
cromosomico e sopravvivenza cellulare)
Stato dell’arte (5)
Instabilità genomica
L’esposizione a radiazioni può dare inizio ad una cascata di
eventi che produce un aumento del rateo di alterazioni nel
genoma delle progenie di cellule irraggiate che non hanno
manifestato un danno immediatamente dopo l’irraggiamento
(effetti tardivi). L’instabilità è stata misurata in termini di una
molteplicità di end-point biologici, ma con particolare attenzione
al danno cromosomico.
Anche tale effetto è stato evidenziato per diverse linee
cellulari (cellule umane normali, linfociti umani, etc..) nonché
per radiazioni sia a basso che ad alto LET.
L’instabilità genomica è stata anche riscontrata nella progenie di
cellule non direttamente irraggiate, ma in comunicazione,
attraverso gap-junction o terreno di coltura, con cellule
irraggiate, evidenziando una possibile relazione di tale effetto
col BE.
Effetti delle basse dosi: Instabilità Genomica
L’esposizione a radiazioni
produce un aumento del
ritmo di mutazioni con
danno cromosomico nella
progenie di cellule
irraggiate
Alterazioni nel cariotipo (numero e morfologia cromosomica) di
cell esposte a dosi di particelle α corrispondenti (in media) a 1
ione/cell
Instabilità cromosomica nel:
•3% di cloni di cell ibride umane/criceto per 1 Gy di RX;
•4% di cloni per 1 Gy di ioni ferro.
Stato dell’arte (6)
Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati
Il metodo di conservazione per lunghi periodi di tempo di
sistemi biologici è la cosiddetta “crio-conservazione”,
ovvero il loro mantenimento, con opportuni trattamenti
preparatori, mediante congelamento, vitrificazione o
ibernazione in opportune installazioni di laboratorio
(dewar per azoto liquido, -196°C, 77 K).
Alle temperature criogeniche i processi biochimici
cellulari sono inibiti e quindi si impedisce la senescenza
cellulare e la degradazione del materiale biologico.
La tecnica è ben conosciuta e praticata (30÷40 anni) ed è
ben misurato il danno prodotto nelle cellule da la
procedura congelamento-scongelamento.
Stato dell’arte (7)
Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati
Dipendendo dall’ambiente in cui i sistemi
biologici crio-conservati vengono depositati,
essi subiranno un irraggiamento protratto
per anni e spesso per decine di anni, come nel
caso delle “banche” di colture cellulari o
delle “banche” di cellule staminali e/o
germinali, a causa del fondo naturale di
radiazioni.
Stato dell’arte (8)
Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati
Dipendendo dal tempo di conservazione e
mancando l’azione antagonista continua dei
meccanismi di riparazione, i “danni” prodotti
dall’esposizione delle cellule crio-conservate al
fondo di radiazioni,
in principio
andranno accumulandosi, trasformando
l’esposizione a “dose protratta” (bassissimo rateo
di dose del fondo ambientale) in esposizione a
“dose acuta”, al momento dello scongelamento e
rivitalizzazione delle cellule. (CRIORAD EXP.)
Stato dell’arte (9)
Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati
Recenti risultati sperimentali ottenuti
confrontando la risposta a raggi-g di diversi
sistemi biologici in condizioni criogeniche e a
temperature ambiente, in termini di vari
end-point biologici, hanno mostrato un
“effetto protettivo”
della crio-conservazione rispetto all’azione
delle R.I (raggi-g)
Attività sperimentale di EXCALIBUR a
Settembre 2009
1.Esperimenti EPR (Electron
Paramagnetic Resonance)
2.Irraggiamenti raggi-X, g e
particelle cariche su cromosomi ed
analisi genomica
3.Irraggiamenti raggi-X, g e
particelle cariche su cellule ed
analisi membranica
Attività EPR (1)
Esperimenti EPR (Electron Paramagnetic Resonance)
per misurare la concentrazione di radicali liberi
prodotti da irraggiamento, allo scopo di:
1. determinare gli effetti dello stato di
crioconservazione sulla natura e distribuzione dei
prodotti radicalici;
2. confronto con la radiolisi in fase liquida;
3. effetti della dose, del rateo di dose e della natura
delle radiazioni.
Attività EPR (2)
Metodologia:
1. preparazione dei campioni di cellule V79, dei terreni di
coltura e di irraggiamento e dei loro componenti;
2. irraggiamenti a 77 oK con radiazioni g da 60Co, raggi X, H+,
D+ ed a;
3. spettroscopia EPR in matrice e in fase liquida con agenti di
spin trapping
Attività EPR (3)
Campioni A1-A9:
A1 : H2O Pura
A2: H2O + DMSO* ( 10%)
A3 : terreno di coltura DMEM completo
A4 : Terreno di coltura DMEM completo + DMSO
A5 : Terreno di coltura DMEM completo + FBS
A6 : Terreno di coltura completo + FBS** + DMSO = terreno di
congelamento
A7 : Cellule in terreno di coltura completo + FBS (1.5x107 cellule totali)
A8 : Cellule in terreno di congelamento(1.5x107 cellule totali)
A9: H2O + FBS
*Dimetilsolfossido (DMSO) per crioprotezione cellulare
**Fetal bovine serum (FBS) da aggiungere al medium di coltura per far
crescere le cellule
Attività EPR (4)
aree irraggiati
a1
3,00E+04
x1
A4 Terreno di coltura DMEM completo + DMSO
A8 cellule in terreno di congelamento
2,50E+04
a3
a4
x2
area
Area
Totale
(U.A.)
a5
2,00E+04
a7
1,50E+04
a8
1,00E+04
a9
5,00E+03
0,00E+00
0
2
4
6
8
10
12
14
tem po irraggiam ento (h)
Tempo di irraggiamento ( h, 0.35 kGy/h)
A5
A1
A9
A3
Terreno di coltura DMEM completo + FBS
acqua pura
acqua + FBS
terreno di coltura DMEM completo
16
18
20
Attività EPR (5)
ANALISI PARZIALE EFFETTUATA:
1. la presenza di DMSO aumenta la produzione di radicali liberi (metilici),
la cui dinamica deve essere studiata;
2. i radicali OH (in misura minore anche i radicali HO2 ) sono dominanti in
H2O pura e sono presenti in tutti i sistemi irraggiati. I radicali OH
decadono a 140 oK senza generare nuove specie per reazione con gli
altri componenti presenti;
3. il fenomeno descritto riduce drasticamente il danno mediato dalla
radiolisi dell’acqua sulle cellule e costituisce una differenza sostanziale
rispetto alla radiolisi in fase liquida;
4. non c’è, per ora, evidenza chiara del danno radicalico diretto o
indiretto sulle cellule. Gli spettri EPR sono sostanzialmente gli stessi
ottenuti dai sistemi senza cellule;
5. dobbiamo aumentare la popolazione di cellule nei campioni e si devono
eseguire misure preliminari con sospensioni delle cellule in acqua pura.
Attività genomica (1)
Il telomero è la regione terminale del cromosoma, da cui deriva il nome
stesso, composta di DNA altamente ripetuto, che non codifica per alcun
prodotto proteico. Ha un ruolo determinante nell'evitare la perdita di
informazioni durante la duplicazione dei cromosomi. La DNA polimerasi,
infatti, non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione;
se non ci fossero i telomeri, che quindi vengono accorciati ad ogni
replicazione, la replicazione del DNA
comporterebbe in ogni occasione
una significativa perdita di informazione
Elizabeth Blackburn, Carol
genetica.
Greider e Jack Szostak,
Vi sono prove che questo progressivo
Nobel per la Medicina 2009,
accorciamento dei telomeri sia
per aver individuato
associato all'invecchiamento della
l'esistenza dei telomeri e
delle telomerasi,
cellula e dell'intero organismo.
correlandone
I telomeri (in giallo) sono evidenziati sui
l’accorciamento con
cromosomi attraverso una Fluorescent in situ
l’invecchiamento cellulare.
hybridization (FISH)
Attività genomica (2)
Il telomero è composto da sequenze ripetute di DNA e da
alcune proteine ed ha la funzione di proteggere le terminazioni
dei cromosomi. Ciò impedisce da una parte la degradazione
progressiva con rischio di perdita di informazione, dall'altra
che tale regione, non presentando una corretta struttura a
doppia elica, sia processata come estremità di filamento
spezzato, con il rischio di fusione tra due regioni telomeriche
di cromosomi diversi.
I telomeri sono estesi dall'enzima telomerasi, che rappresenta
una classe di retrotrascrittasi specializzate, presenti in
numerosi organismi (tra cui l'uomo), ma non in tutti (e
soprattutto non in tutte le fasi dello sviluppo). In particolare,
nell'uomo le telomerasi (così come nella maggior parte degli
eucarioti multicellulari) sono attive solo nelle cellule della linea
germinale: ciò significa che, ad ogni replicazione, i telomeri
umani si accorciano di un certo numero di paia di basi.
Attività genomica (3)
Esistono teorie che associano il continuo accorciarsi dei telomeri con la
senescenza delle cellule della linea somatica e con la prevenzione del
cancro. Questo perché i telomeri agirebbero come una sorta di orologio
biologico, legato cioè ad un numero massimo di mitosi (e di replicazioni del
DNA), al termine del quale la cellula sarebbe troppo vecchia per essere
mantenuta in vita e prenderebbe la via dell'apoptosi. Per garantire un
efficace ricambio cellulare, in ogni caso, in molti tessuti dell'organismo
sono presenti cellule staminali, che mantengono la corretta lunghezza dei
telomeri attraverso la presenza di telomerasi attive.
Il meccanismo molecolare attraverso cui i telomeri troppo corti possono
portare alla morte cellulare sembra essere legato alla perdita del loro
corretto ripiegamento naturale (evento legato ad una loro dimensione
troppo ristretta). Secondo alcune teorie comunemente accettate, la cellula
è infatti in grado di riconoscere questo diverso ripiegamento come danno al
DNA, avviando il processo dell'apoptosi sulla base dell'attività di molecole
come p53. Tale processo di morte cellulare può anche essere avviato da
una fusione tra cromosomi.
Attività genomica (4)
Nell'uomo, la sequenza ripetuta nei telomeri è composta di sei
nucleotidi TTAGGG, ripetuti per una lunghezza che va da 3 a
20 kilobasi. Sono presenti 100-300 kilobasi addizionali di
ripetizioni telomero-associate, che si dispongono tra il
telomero ed il resto del cromosoma. La sequenza telomerica
varia da specie a specie.
Tipo di organismo
Sequenza telomerica
Vertebrati
TTAGGG
Piante Superiori
TTTAGGG
Alghe Verdi
TTTTAGGG
Insetti
TTAGG
Attività genomica (5)
Le misure finora effettuate (4 Gy) mostrano che:
1. i fibroblasti, di uomo e di topo, esibiscono differenti
comportamenti, per quanto riguarda la lunghezza del
telomero, per iraggiamenti con radiazioni di basso od alto
LET: accorciamento per basso LET, allungamento per alto
LET;
2. la qualità della radiazione e la conseguente complessità del
danno indotto a livello del DNA, sembrano giocare un ruolo
nell’attivazione dei processi di ricombinazione a livello del
telomero;
3. è del tutto sconosciuto, a nostra conoscenza, il significato
radiobiologico di questo allungamento del telomero (genomic
instability??).
Attività genomica (6)
ISIS Software “Metasystems”
T/C% =
Tel fluo
Cen 2 fluo
X-rays
3 MeV protons
40
Telomere length (T/C%)
35
*
30
X rays
96 hrs
24 hrs
*
Number of Telomeres = 2204
Mean length = 25,65
St. Dev. = 17,03
Number of Telomeres = 1808
Mean length = 25,51
St. Dev. = 15,45
25
0 Gy
20
28,5 keV/um protons
*
50
40
30
20
10
0
50
40
30
20
10
0
1
15
11
21
31
41
51
61
71
81
1
91
11
5
4 Gy
0
0
4
0
Doses (Gy)
4
31
41
51
61
71
81
91
Number of Telomeres = 1818
Mean length = 29,58
St. Dev. = 18,07
Number of Telomeres = 1810
Mean length = 17,87
St. Dev. = 11,79
10
21
50
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0
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10
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1
11
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31
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51
61
71
81
91
Attività membranica (1)
La risposta cellulare all’irraggiamento, è stata analizzata in
termini di misure di correnti ioniche (il canale del K+) con la
tecnica del patch clamp, cioè bloccando la differenza di
potenziale elettrico in una piccola area della membrana
cellulare o dell'intera cellula. L'estremità di una pipetta di
vetro ( 1 mm e 1010 W) viene fatta aderire perfettamente
alla membrana cellulare permettendo così di isolare una
piccola area della membrana stessa e i canali ionici in essa
presenti. A questo punto è possibile modificare e manipolare
chimicamente o elettricamente i canali stessi in modo da
studiarne le proprietà.
Attività membranica (2)
Curve I-V
ottenute in
seguito ad
irraggiamenti g
con diversi
valori di dose,
registrate
tramite la
tecnica
del patch clamp
in cellule V79
Attività membranica (3)
Curve I-V
ottenute in
seguito ad
irraggiamenti
con p da 3
MeV, registrate
tramite la
tecnica
del patch clamp
in cellule V79