Dosaggio ELISA di lipoproteine HDL
Classi di Immunoglobuline: IgM, IgG,
IgA, IgD e IgE
Antigene
epitopi
Anticorpi (Ig)
Antigene: componente strutturale di
batteri, virus,funghi; ex. proteine e
polisaccaridi della parete cellulare di
batteri.
Ogni Ig riconosce un singolo epitopo: clone di linfocita B
e risposta monoclonale; un antigene origina una risposta
policlonale: cloni di linf B diretti verso i vari epitopi della molecola
Antigeni self e non-self. Fisiologia: risposta anticorpale verso
antigeni non self (batteri, virus, funghi, elminti, etc..).
Patologia: risposta anticorpale anche verso antigeni self
ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Dosaggio quantitativo di sostanze sfruttando la reazione antigene-anticorpo (Ag-Ab) e la
formazione di immunocomplessi. E’ un test affidabile e sensibile,utilizzato in molti dosaggi
analitici di routine. Versatilità diagnostica: microbiologia, autoimmunità, monitoraggio
farmacologico, etc...
Combina la specificità degli anticorpi con la sensibilità dei dosaggi enzimatici
Principio: Sfrutta la capacità delle superfici di plastica a legare stabilmente le proteine. E’ un
saggio in fase solida effettuato su piastre da microdosaggio a 96 pozzetti: queste permettono di
testare contemporaneamente un elevato numero di campioni e volumi molto piccoli. Si sfrutta
la specificità della reazione Ag-Ab e la formazione dell’immunocomplesso “fissato” al fondo
del pozzetto che viene riconosciuta per la marcatura di una delle due componenti (Ag o Ab)
con un enzima (E) il cui prodotto di reazione è colorato e misurabile spettrofotometricamente.
Tecnologia molto diversificata - schematicamente: ELISA diretto, indiretto, test sandwich
Diretto  1) Ag del campione viene fatto legare alla piastra e questo viene misurato aggiungendo un Ab
specifico primario direttamente legato a E che fa avvenire la reazione colorimetrica ; 2) viene fatto
aderire previamente alla piastra l’ Ab specifico per l’ Ag realizzando poi una competizione con una
quantità nota di Ag marcata con E (test competitivo).
Indiretto  Viene aggiunto rispetto al test diretto un passaggio con un altro Ab detto secondario,
specifico o per l’Ag o per l’Ab primario. L’Ab secondario è legato a E per la rivelazione.
Sandwich  E’ un sottotipo di dosaggio ELISA : Ab legato alla piastra si legherà all‘Ag a cui si legherà
Ab secondario marcato con l’enzima che lega un altro epitopo dell’Ag. Ne esistono numerose varianti ,
dirette o indirette.
Limite: provvede informazioni solo sulla presenza/concentrazione di una molecola, non dando
informazioni sulle sue proprietà biochimiche (es peso molecolare, localizzazione cellulare, ecc
Principio della metodica
ELISA indiretto - antigene legato alla piastra
ELISA indiretto – anticorpo legato alla pistra
Lettura a 405 nm
Fosfatasi alcalina
P-NPP
•L’antigene viene purificato e legato alla piastra.
•Si aggiunge il siero/plasma da analizzare. Se presenti, le immunoglobuline specifiche per
l’antigene formano il complesso antigene-anticorpo.
•Le molecole che non si sono legate vengono eliminate tramite lavaggi.
•Si aggiunge un secondo anticorpo marcato, che abbia specificità per le immunoglobuline della
specie da cui il siero/plasma testati derivano. Il secondo anticorpo si lega al complesso antigeneanticorpo immobilizzato sulla piastra.
•La quantificazione avviene misurando la quantità di anticorpo secondario legato, grazie
all’utilizzo di substrati colorimetrici.
ELISA: enzimi e substrati
Caratteristiche dei substrati:
• composto stabile
• sicuro, non tossico
• poco costoso
Il metodo più utilizzato per la rivelazione dell’avvenuto legame antigene-anticorpo
consiste nella coniugazione dell’anticorpo secondario con una molecola che può essere
direttamente rivelata.
Anticorpi coniugati ad enzimi: vengono utilizzati enzimi in grado di convertire un
substrato incolore in un prodotto colorato.
• Fosfatasi Alcalina: per anticorpi coniugati alla fosfatasi alcalina si usa in genere il
substrato p-nitrofenilfosfato (pNPP), che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a
405-410 nm.
• Perossidasi: per gli anticorpi coniugati alla perossidasi vi sono vari substrati che danno
prodotti diversi. La misura è sempre colorimetrica.
ELISA: diluizioni seriali
L’obiettivo del test ELISA utilizzato è quello
di stimare la concentrazione di HDL. Questo
è possibile ottenendo una retta standard dalla
quale ottenere la concentrazione incognita
nel campione di siero dei soggetti in analisi.
Il
test
viene
eseguito
diluendo
progressivamente sia la preparazione
standard (concentrazione nota) sia il siero
(concentrazione sconosciuta nei soggetti). Lo
standard
viene
solitamente
diluito
serialmente:
es 2-fold: 2-4-8-16-32-64-128-…….
Si ottiene una curva standard utilizzata per
determinare la concentrazione dell’HDL nei
soggetti in analisi. I sieri dei campioni da
analizzare vengono diluiti una sola volta,
dopo aver opportunamente valutato la
diluizione.
Esempio di diluizione seriale 1/10
Controllo positivo
Controllo negativo
Calibratori : determinazione della
concentrazione dell’analita
ELISA: quantificazione dei risultati
Il colore sviluppato dalla reazione
dell’enzima coniugato all’anticorpo
secondario è proporzionale alla
concentrazione di analita presente nel
campione di siero analizzato e rimasto
legato alla piastra mediante l’ antigene.
La quantificazione può essere ottenuta
dalla curva standard. Se il campione
rivela un valore di assorbanza > controllo
negativo e/o compreso tra i valori del siero
calibratore si determina la quantificazione
in base alla retta di taratura.
Colesterolo
E’ uno sterolo, cioè una molecola costituita da
quattro anelli policicloalifatici (condensati tra
loro in formazione trans) e una coda alifatica,
oltre ad eventuali gruppi funzionali, come
l'ossidrile, che fa sì che il composto sia un alcol
cicloalifatico.
Funzioni
Il colesterolo fa parte della membrana cellulare di tutte le cellule animali: si inserisce
fra gli due strati di fosfolipidi orientandosi con il gruppo -OH vicino alle teste polari
dei fosfolipidi, diminuendo così la fluidità del mosaico ma aumentando la stabilità
meccanica e la flessibilità delle cellule.
Assieme con molecole proteiche il colesterolo regola lo scambio di sostanze
messaggere tramite la membrana cellulare.
Il colesterolo è la sostanza base per la sintesi degli ormoni steroidei (aldosterone,
cortisone, testosterone, estradiolo)
Il colesterolo prodotto nel fegato viene impiegato in buona parte per la produzione di
bile (emulsiona i lipidi alimentari per renderli assorbibili dall'intestino tenue)
Trasporto del colesterolo
Il colesterolo insieme ai trigliceridi vengono
trasportati nel plasma sotto forma di
lipoproteine caratterizzate da un nucleo
contenente lipidi non polari (esteri del
colesterolo e triglicerdi) circondato da un
rivestimento polare di fosfolipidi, colesterolo
libero e apoproteine
Secondo la loro composizione in colesterolo, fosfolipidi, proteine, trigliceridi e acidi
grassi, questi aggregati vengono ulteriormente distinti in diverse classi: VLDL, IDL,
LDL, HDL2 e HDL3.
I chilomicroni sono i principali trasportatori di triacilgliceroli, mentre le LDL sono i principali
trasportatori di colesterolo.
I chilomicroni, secreti dall’intestino, trasportano tutti i lipidi e le molecole lipofile assorbite dalla
dieta ai vari distretti dell’organismo. I chilomicroni residui sono poi assorbiti dal fegato, che
rilascia le VLDL, particelle che trasportano lipidi endogeni prodotti dagli epatociti e lipidi
esogeni. Dopo aver rilasciato i triacilgliceroli ai tessuti periferici, le VLDL diventano LDL. Le
LDL sono i principali trasportatori plasmatici di colesterolo ai tessuti extraepatici.
Le HDL, secrete dal fegato, svolgono invece un ruolo inverso: legano il colesterolo rilasciato nel
plasma dal turnover cellulare e lo riportano al fegato dove avviene il catabolismo.