Saggio Immunoenzimatico ELISA
diretto o a "sandwich”: accertare la
presenza di un antigene;
indiretto: accertare la presenza di un
anticorpo specifico contro un antigene
ELISA DIRETTO:
1)Ieri coating con anticorpo anti IL-2
2)Stamattina blocking con PBS-BSA3%
3)CAMPIONI e curva standard: su piastra diversa preparare diluizione
campioni MLR e curva standard.
Campioni tal quale + 3 diluizioni 1:2, partire da volume di 250 µl,
diluire in 125µl di reagent diluent
Curva standard fare 7 diluizioni a partire da 2ng/ml, dil 1:2, da volume
di 250 µl, diluire in 125µl di reagent diluent, 8° pozzetto SOLO reagent
diluent.
CONC. Iniziale rIL-2 140 ng/ml
4) 2 lavaggi con 200µl PBS-TWEEN 0,05%, poi 50 µl/well
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
E10
E11
E12
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
PIASTRA ELISA
1:2
1:2
1:2
1:2
1:2
1:2
PIASTRA “gemella” x diluizioni
prepare 250µl di IL-2 2ng/ml in RD (Ci IL2 140 ng)
PIASTRA “gemella” x diluizioni
prepare 250 ul di IL2 2 ng/ml in RD (Ci IL2 140 ng)
1:2
Dilute1:2 from well A1; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A1)
1:2
Dilute1:2 from well A2; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A2)
1:2
Dilute1:2 from well A3; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A3)
…
1:2
1:2
1:2
ONLY 125 ul RD
250 µl
STD
125 µl
125 µl
125 µl
125 µl
125 µl
125 µl
125 µl
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
bianco
PIASTRA ELISA
PIASTRA “gemella” x diluizioni
Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes
eg. hormones
drugs
tumour antigens
cytokines
Direct: sandwice ELISA to detect Antigenes
Coating
1. Anti-analyte
capture antibody purified
Blocking
2. BSA 1-3%
1. Anti-analyte
Standard-Sample
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Detection
4. Antibody-biotinilated
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
biotin
biotin
Conjugation
5. Streptavidin-enzyme HRP
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Substrate
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
6. TMB
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB)
Liquid Substrate System for ELISA
5. Streptavidin-enzyme
Streptavidin-HRP
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Stop reaction
7. H2SO4
1N
6. TMB
5. Streptavidin-enzyme
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Analisi Quantitativa:
la retta standard nel saggio diretto Sandwich, y=mx+q
L’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di enzima
La quantità di enzima presente nel pozzetto è proporzionale alla quantità di
anitcorpo secondario
La quantità di anticorpo secondario è proporzionale alla quantità di ANTIGENE
Quindi l’intensità della
reazione colorimetrica
è proporzionale alla
quantità di antigene!
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Per domani portare un
computer per gruppo
analisi elisa sandwich
[email protected]
Lab. 5013 - ed. U4, 5° piano
Uff. 2027/B - ed. U3, 2° piano