Introduzione ai
trattamenti biologici:
Cenni di microbiologia
e cinetica biologica
Claudio Lubello
Corso Ingegneria Sanitaria
21/12/2015
I microrganismi
21/12/2015
La suddivisione degli esseri viventi:
classificazione filogenetica
MACRORGANISMI
Albero filogenetico della vita come definito dalla comparazione dell’RNA ribosomale.
L’albero è costituito da tre domini degli organismi: Bacteria ed Archaea che hanno una
cellula
di tipo procariotico ed Eukarya, di tipo eucariotico. In rosso sono cerchiati i
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macrorganismi tutti gli altri sono quelli comunemente indicati come MICRORGANISMI.
Procarioti ed Eucarioti
Eucariote: organismo costituito da cellule con nucleo ben differenziato e separato dal citoplasma
per mezzo di una membrana nucleare.
Procariote: organismo unicellulare il cui materiale cellulare non è racchiuso dentro una specifica
21/12/2015
membrana.
Manca la suddivisione della funzione cellulare in specifici organuli.
Batteri
I batteri sono organismi
procarioti costituiti da una
singola cellula.
Le cellule batteriche si
riproducono per scissione
binaria.
I batteri possono essere di
differente forma:
- SFERICA (Cocchi),
- a BASTONCINO (Bacilli),
- ELICOIDALE (Spirilli).
-3
In genere le cellule batteriche sono lunghe da 1 a 10 micrometri (10 mm) e hanno
sviluppato gli adattamenti più svariati per ottenere energia e sostanze nutritive.
Si trovano in quasi tutti gli ambienti: nell'aria, nel suolo, nell'acqua, nel ghiaccio,
nelle sorgenti calde e perfino negli sbocchi idrotermali delle profondità oceaniche.
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Composizione tipica dei batteri
Elementi
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%TSS
Formula
empirica (%VSS)
Alghe verdi-azzurre
Da non confondersi con le alghe. Sono cianobatteri ed
appartengono al dominio dei BACTERIA.
Sono organismi
fotosintetici.
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Alghe
Rientrano fra le alghe numerosi organismi eucariotici che
contengono clorofilla e svolgono la fotosintesi. La maggior
parte sono microscopiche (quelle di nostro interesse), sono
presenti tuttavia organismi macroscopici di dimensione
molto elevata.
Le alghe contengono clorofilla e si
presentano di colore verde,
possono assumere colori diversi
(marrone o rosso) per la presenza
di altri pigmenti.
Colonie di Volvox
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Protozoi
I protozoi sono organismi
eterotrofi generalmente
unicellulari, sprovvisti di
una ben delimitata parete
cellulare. La maggior parte
è mobile. Possono essere
patogeni per l’uomo o per
altri animali.
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Funghi
Sono organismi eterotrofi pluricellulari, caratterizzati dalla
presenza di una parete cellulare e dalla produzione di
spore.
I gruppi di maggiore importanza sono: muffe, lieviti e funghi
fruttiferi.
Muffe:
Sono funghi con struttura filamentosa, caratteristici per le loro
efflorescenze polverose di colore bianco-grigio, verdastro, nero. Si
riproducono tramite spore che differiscono nella morfologia, nel modo in
cui sono prodotte, nel colore. Le loro condizioni ottimali di pH sono di circa
5,6 con intervallo tra 2 e 9.
Lieviti:
Funghi unicellulari che vivono in habitat liquidi o umidi.
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Virus
I virus non sono cellule ma
particelle composte da acidi
nucleici (DNA o RNA)
racchiusi in un involucro
proteico
Il termine virus significa, “veleno” e venne usato per la prima
volta per indicare particelle patogene più piccole dei batteri. Essi
non possiedono molti degli attributi tipici delle cellule ed, in
particolare, sono sistemi dinamici e aperti in grado di assimilare
nutrienti ed espellere metaboliti.
Sono
21/12/2015parassiti intracellulari obbligati e solo quando infettano
una cellula sono in grado di riprodursi.
Metabolismo microbico
Percorsi metabolici e
conseguente classificazione dei
microrganismi
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Il metabolismo dei microrganismi
Un organismo per potersi riprodurre e
funzionare correttamente ha bisogno di:
- Energia
- Carbonio
- Elementi inorganici (nutrienti)
- Fattori di crescita (amminoacidi, vitamine, basi azoto, …)
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Anabolismo e Catabolismo
Le attività metaboliche seguono due percorsi metabolici diversi:
- cammino anabolico (consumo di energia), che è un
processo assimilativo che comporta la sintesi dei
componenti della cellula (biosintesi),
- cammino catabolico (rilascio di energia), che è un
processo dissimilativo. Le sostanze assunte vengono
degradate attraverso una serie di passaggi intermedi fino a
prodotti stabili. In questi passaggi si rende disponibile
l’energia necessaria per la crescita e il mantenimento.
I due processi si completano l’uno con l’altro.
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Ossido riduzione
Nei sistemi biologici la produzione e la
conservazione dell’energia coinvolge reazioni
di ossido-riduzione (redox). In queste si ha uno
scambio di elettroni tra un elemento donatore
che si ossida, ed un elemento accettore che si
riduce.
Le reazioni redox rispetto ad altre reazioni
chimiche, hanno un valore più elevato della
resa di energia per mole di reagenti coinvolti.
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ATP
ATP (Adenosintrifosfato): è la molecola che nel metabolismo delle cellule svolge
l’importante funzione energetica di accumulare energia fornita dal catabolismo e di
fornirla successivamente per le reazioni metaboliche, comportandosi come una sorta
di batteria. L’ATP è costituito da un gruppo adenosina e tre gruppi fosfatici.
Quando l’ATP perde un gruppo fosfatico, la rottura del legame rilascia una grande
quantità di energia e si forma ADP (adenosindifosfato).
ATP  ADP + Pi + energia
Con un meccanismo di ricarica l’energia fornita dal catabolismo viene accumulata
dalla reazione inversa.
ADP + Pi + energia  ATP
È opportuno evidenziare l’importanza del fosforo che deve essere sempre presente per
garantire lo svolgimento delle reazioni metaboliche.
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ATP
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ATP
Re az io n i Cat abo lic h e
Generazione di energia libera
SUBSTRATO
(Fonte energetica)
ATP
a
o r il z i o n e
sf
Re az io n i An abo lic h e
Consumo di energia libera
li s i
scambio
di
energia
ro
id
²G
fo
.
ADP
Sintesi della biomassa
PRODOTTI METABOLICI
Metabolismo di mantenimento
iodrolisi ATP
Fosforilazione ADP
ATP  H2O
ADP  Pi
ATPasi
ADP  Pi
Fosforilazione
ATP
²G = - 7kcal/mole
²G = 7kcal/mole
Illustrazione schematica del ruolo svolto dall’ATP nel metabolismo
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Schema del ruolo svolto dall’ATP nel metabolismo
Reazioni Cataboliche
Generazione di energia libera
ATP
SUBSTRATO
(Fonte di Energia)
Scambio
di
energia
ADP
Prodotti metabolici
Reazioni Anaboliche
Consumo di energia libera
Sintesi della biomassa
Idrolisi ATP
Fosforilazione ADP
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ATP+H2O
ADP+Pi
ADP+Pi
ATP
Metabolismo di
mantenimento
Enzimi e coenzimi
Gli enzimi negli organismi viventi hanno il compito di velocizzare le reazioni
biochimiche che, in loro assenza, avverrebbero tempi lunghi, non compatibili
con il metabolismo cellulare. Alcuni enzimi per svolgere la loro attività hanno necessità di
un 21/12/2015
composto addizionale, che può essere costituito da ioni inorganici o da molecole organiche
dette coenzimi
Enzimi
Cinetica enzimatica
La velocità della reazione globale aumenta proporzionalmente alla
concentrazione del substrato e quindi del complesso E-S. Come si può notare
dalla figura, questo incremento decresce sino al raggiungimento di un plateau
in cui la concentrazione di S è così elevata da mantenere sempre saturo
l’enzima; in queste condizioni la velocità di reazione per unità di enzimi (o
batteri), V/E, è massima e pari a k.
La relazione tra concentrazione di substrato e la velocità è stata studiata da
Michaelis- Menten
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Nutrienti
Elementi
Forma più comune in natura
Carbonio
CO2, composti organici
Azoto
NH4+, NH3, NO3-, N2, composti organici azotati
Idrogeno
H2O, composti organici
Ossigeno
H2O, O2, composti organici
Fosforo
PO43-
Zolfo
H2S, SO42-, comp. organici, metalli solfati
Potassio
K + in soluzione o Sali di potassio
Magnesio
Mg2+ in soluzione o Sali di magnesio
Sodio
Na+ in soluzione o Sali di sodio
Calcio
Ca2+ in soluzione o Sali di calcio
Ferro
Fe2+ o Fe3+ in soluzione o come Sali di Ferro
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Classificazione dei microrganismi
I principali elementi che devono essere considerati
per la classificazione dei microrganismi sono:
SORGENTE DI CARBONIO: viene convertito in materiale
cellulare (protoplasma)
DONATORE DI ELETTRONI (SUBSTRATO): alimenta la
semireazione di ossidazione e rappresenta la fonte di
energia nel cammino catabolico.
ACCETTORE DI ELETTRONI: alimenta la semireazione di
riduzione nel cammino catabolico.
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Fonte di Carbonio
Eterotrofi: organismi che utilizzano
come fonte il carbonio
contenuto nei composti
organici
Autotrofi: organismi che utilizzano
come fonte di carbonio la
CO2
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Energia
Le cellule richiedono energia per le attività di sintesi e di
mantenimento. L’energia può essere ottenuta da tre fonti
diverse:
I microrganismi che utilizzano la luce come sorgente di
energia sono detti FOTOTROFI;
quelli che invece usano l’energia chimica sono definiti
CHEMIOTROFI.
-
Composti chimici organici
-
Composti chimici inorganici
Chemiorganotrofi
CHEMIOTROFI
Chemiolitotrofi
-
Luce
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FOTOTROFI
Energia
Classificazione in funzione del ruolo
dell’ossigeno
I diversi tipi di metabolismo possono essere distinti sulla base delle
modalità con le quali viene prodotta l’energia necessaria per le
funzioni vitali. In particolare sulla necessità o meno dell’ossigeno
come accettore finale delle reazioni di ossido-riduzione.
Metabolismo aerobico quando l’ossigeno funge da accettore finale
degli elettroni (i microrganismi che sfruttano questo metabolismo
sono detti AEROBICI)
Metabolismo anaerobico quando viene utilizzato un accettore finale
di elettroni diverso dall’ossigeno (i microrganismi sono detti
ANAEROBICI).
Un caso particolare di metabolismo anaerobico è quello in cui gli
accettori finali di elettroni siano i nitriti e/o i nitrati. Si parla in questo
caso di Metabolismo anossico (spesso svolto da microrganismi
FACOLTATIVI, che cioè in presenza di ossigeno usano questo
come accettore ed in sua assenza nitriti e nitrati).
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Respirazione e Fermentazione

Respirazione: ossigeno molecolare o altro composto
inorganico come accettore di e-. Il substrato organico viene
ossidato a CO2.

Fermentazione: assenza di un accettore di e- esterno.
Vengono utilizzati gli stessi composti organici donatori.
La fermentazione è caratterizzata in termini energetici da una
resa inferiore alla respirazione (minore velocità di crescita
ed inferiori rendimenti di sintesi)
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Condizioni potenziale redox
Fermentazione
Respirazione
anossica
anaerobica
Trasformazione
del Carbonio
C
Substrato
organico
Prodotti di
Substrato
fermentazione
organico
Flusso
interno
di e-
Accettore di
elettroni
Respirazione
aerobica
C
C
Substrato
CO
2
CO
organico
e-
N O 3 -,
SO 4 --,
e-
CO 3 --
O2
Ossido-Riduzioni
interne
POTENZIALE REDOX
molto
negativo
debolmente negativo
o circa zero
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positivo
2
Classificazione processi metabolici
Tipo
Reazione
Fonte C
Donatore e-
Accettore e-
Prodotti
Aerobico
eterotrofo
Respirazione
Aerobica
Composti
Organici
Composti
Organici
O2
CO2, H2O
Aerobico
autotrorfo
Nitrificazione
CO2
NH4+, NO2-
O2
NO2-, NO3-
Aerobico autotr.
Ossidazione Ferro
CO2
Fe (II)
O2
Fe (III)
Aerobico autotr.
Ossidazione Solfuri
CO2
H2S
O2
SO42-
Facololtativo
Eterototrofo
Denetrificazione
Anossica
Composti
Organici
Composti
Organici
NO2-, NO3-
N2, CO2, H2O
Anaeraerobico
Eterotrofo
Fermentazione
Acida
Composti
Organici
Composti
Organici
Composti
organici
VFA
Anaerobico
Eterotrofo
Riduzione Ferro
Composti
Organici
Composti
Organici
Fe (III)
Fe(II), CO2,
H2O
Anaerobico
Eterotrofo
Riduzione Solfati
Composti
Organici
Composti
Organici
SO42-
H2S, CO2, H2O
Anaerobico
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Eterotrofo
Metanogenesi
Composti
Organici
Acidi Grassi
Volatili (VFA)
CO2
Metano
Definizione dei parametri
cinetici
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Velocità e tasso di crescita
Sia nei reattori batch, che in quelli a flusso continuo la velocità
(rateo) di crescita dei batteri può essere definita dalla seguente
relazione:
rg 
dX
dt
in cui
rg è la velocità di crescita batterica (massa/unità di volume x tempo)
X è la concentrazione di microrganismi (massa/unità di volume)I
Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla
concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita:

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1 dX
X dt
Velocità e tasso di respirazione
endogena
L’attività di respirazione endogena corrisponde all’utilizzo come fonte di
carbonio ed energia lo stesso materiale cellulare. Tale fase è sempre
presente in contemporanea con la crescita cellulare. Diventa l’attività
prevalente quando il substrato è esaurito.
La velocità (rateo) di respirazione endogena dei batteri è definita dalla
seguente reazione:
rd  
dX
dt
in cui
rd è la velocità di respirazione endogena (massa/unità di volume x tempo)
Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione
X della biomassa si introduce il tasso di respirazione endogena:
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1 dX
kd  
X dt
Velocità di crescita netta
La velocità di crescita netta è data dalla differenza fra quella di
crescita e quella endogena (che comporta un consumo del
materiale cellulare).
r’g = rg - rd
in cui
rd è la velocità di respirazione endogena (massa/unità di volume x
tempo)
Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla
concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita
netta:
’ =  - kd
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Velocità di utilizzazione del
substrato
La velocità di utilizzazione del substrato (termine con cui spesso si indica il
donatore di elettroni) rappresenta la velocità con cui i batteri utilizzano il
substrato:
rsu  
dS
dt
in cui
rsu è la velocità di utilizzazione del substrato (massa/unità di volume x tempo)
S è la concentrazione del substrato (massa/unità di volume)
Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X
della biomassa si introduce il tasso di utilizzazione del substrato:
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U 
1 dS
X dt
Fattore di resa
(rendimento di crescita)
Una parte del substrato è convertito in prodotti inorganici ed organici finali
mentre un’altra parte porta alla formazione di nuove cellule. La successiva
relazione mette in relazione il tasso di utilizzazione del substrato (rsu
massa/unità di volume x tempo) con rg il tasso di crescita batterico:
rg 
dX
dt
rsu  
dS
dt
dX / dt
dS X
dX 1
Y



essendo 
rsu  dS / dt
dt
Y
dt X
rg
In cui Y (massa/massa) è il fattore di resa.
Tenendo conto che una parte del biomassa viene degradata a causa della
respirazione endogena è utile introdurre il fattore di resa osservato Yobs:
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Yobs 
r 'g
rsu
Esempio di calcolo del fattore di resa
Calcoliamo Y nel caso di un substrato noto (p.es. formaldeide CH2O)
8 CH 2 O  3O2  NH3  C5 H7 NO2  3CO2  6 H 2O
substrato


Y 
biomassa
Peso molecolare del substrato CH2O = 30
Massa atomica C = 12 ; N = 14; H = 1; O = 16
Peso molecolare della biomassa C5H7NO2 = 113
Biomassaprodotta
C H NO2
113
 5 7

 0.47 g SSV/ g substrato
Substrato consumato 8 CH2O
8  30
Il fattore di resa può anche essere calcolato come:
gCOD (nella biomassa prodotta) /gCOD (nel substrato degradato)
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Calcolo di Y in termini di COD

Equivalenza COD/substrato:
8 CH2 O  8O2  8 CO2  8H2O
f COD

8  O2
8  32


 1.06 gCOD / g substrato
8  CH2O 8  30
Equivalenza COD/biomassa:
C5 H 7 NO2  5O2  5CO2  2H 2O  NH3
fX 

5 O2
5  32

 1.42 g CODcell / g biomassa
C5 H7 NO2
113
Pertanto Y: Y  biomassa  0,47
21/12/2015
substrato
gSSV
0,47  1,42
gCOD

 0,63
gsubstrato
1,06
gCOD
Tasso di crescita e concentrazione del
substrato
Una relazione empirica della relazione esistente fra il tasso di crescita della
biomassa e la concentrazione di substrato, largamente utilizzata nella
pratica, è quella ricavata da Monod derivata dalla cinetica enzimatica di
Michelis-Menten:
   max
S
KS  S
Sostituendo questa espressione nella definizione del fattore di resa si ha:
rg
dX / dt
dS X
dX 1
 max SX
kSX
Y





essendo


rsu 

rsu  dS / dt
dt
Y
dt X
Y KS  S KS  S
Dove k è il tasso massimo di utilizzazione del substrato, pari a μmax/Y.
Ks rappresenta il valore della concentrazione del substrato al quale
corrisponde un tasso di crescita pari alla metà del tasso massimo.
Si noti che
Per S>>Ks
Per S<< Ks
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 = max
 = maxS/Ks
(cinetica di ordine zero)
(cinetica di ordine uno)
Proprietà della cinetica di
crescita
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Effetto della costante di semisaturazione
Andamento rateo di crescita
7
KS = 10
6
KS = 50
Rateo di crescita (1/d)
5
KS = 100
4
3
2
1
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Substrato (mg/l)
All’aumentare del substrato disponibile il tasso di crescita aumenta fino ad un
valore massimo. Si noti come in presenza di alti valori di Ks il rateo massimo di
crescita si ottiene per valori più elevati dalla concentrazione del substrato, mentre
con
valori bassi di Ks si ottiene già con basse concentrazioni.
21/12/2015
Sostanze inibitrici dei processi di
crescita
Oggi le acque reflue raccolgono spesso sostanze tossiche (composti
organici o metalli pesanti) che possono diventare inibitori della
crescita microbica impedendo così il funzionamento dei sistemi
biologici di depurazione. Tale effetto di inibizione si esplica,
solitamente, superando una definita soglia di concentrazione.
Per esempio, nel caso di microrganismi eterotrofi, alcune soglie sono
riportate di seguito:
Arsenico 0.05 mg/l; Cadmio 1 mg/l; Cromo tot. 10 mg/l; Cromo esa. 1
mg/l; Rame 1 mg/l, Piombo 0.1 mg/l; Mercurio 0.1 mg/l; Nickel 1
mg/l; Zinco 1 mg/l.
Nel caso di microrganismi autotrofi nitrificanti le soglie sono inferiori.
21/12/2015