• Divisione in gruppi di tre persone
• Assegnazione di tre articoli originali per gruppo.
Gli articoli sono divisi in tre tematiche (A, B, C)
• Ciascun componente del gruppo sceglie uno
dei tre articoli da presentare in un breve
seminario secondo un calendario prestabilito.
Gli altri due componenti del gruppo dovranno
prepararsi a rispondere a domande (semplici)
sull’articolo alla fine del seminario dei
compagni di gruppo
VALUTAZIONE
• Seminario da 0 a 6
• Domande ai componenti dello stesso gruppo di
chi presenta (una per seminario) da 0 a 2
• Esame finale da 8 a 20
• Altri elementi che potranno contribuire al voto
finale: 1) interventi durante la discussione dei
seminari, 2) presenze
IMPACT FACTOR
NATURE
25.814
SCIENCE
23.872
CELL
32.44
EMBO J
13.999
MOL CELL BIOL
9.666
J BIOL CHEM
7.368
EUR J BIOCHEM
2.852
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articoli
originali
rassegne
“reviews”
libri di
testo
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Schema
trasferimento e
ibridazione
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Altre tecniche di analisi
• Estensione del primer (primer extension)
• Protezione dalla S1/RNasi (mapping)
• RT-PCR
mRNA totale
Estensione del primer
(primer extension)
cap
mRNA globina
3’
ibridazione
5’
oligo antisenso
marcato
estensione con RT
Analisi dei frammenti estesi
su gel di sequenza
frammento
protetto
Protezione da RNasi (RNase Protection)
mRNA totale
Protezione da RNasi
(RNase Protection)
cap
mRNA globina
3’
5’
sonda RNA antisenso
ibridazione
trattamento con RNasi
Analisi dei frammenti
protetti su gel di
sequenza
frammento
protetto
Protezione da RNasi (RNase Protection)
Analisi interazioni
DNA-proteine:
saggio di footprinting
Analisi interazioni
DNA-proteine:
saggio EMSA
Coimmunoprecipitazione
Affinity co-purification
(pull down)
Sistema dei due ibridi
Sistema dei due ibridi
Sistema dei tre ibridi
Chromatin immunoprecipitation (Chip)
Biologia molecolare - Robert F. Weaver
Copyright © 2005 – The McGraw-Hill Companies srl
An example of a ChIP assay done in yeast using an antibodies raised against the gene-specific transcription factor
Gal4 and the general transcription factor and proteasome constituent Sug1. Different PCR primers (amplifying DNA
segments A-E) were employed to probe for the presence of the two proteins along the GAL1 gene under non-inducing
(raffinose) or inducing (galactose) conditions. Gal4 is known to be localized to the promoter. Therefore, the ChIP
signals in regions B and C for this protein reflect the presence of longer DNAs in the sample which are co-IP’d with
Gal4 and amplify using the B and C region primers. This reflects the relatively low resolution of the ChIP assay. Sug1
is an elongation factor and is therefore found throughput the gene.
Sistemi di espressione
• In vitro: - estratti cellulari
• In vivo: - cellule in coltura
- animali transgenici
Gene reporter
Vettori di clonaggio per lievito
Ricombinazione omologa
Trasfezione di cellule in coltura
• transiente
• stabile
• vettori episomali
Trasfezione in cellule in
coltura
Vettori episomali
Topi transgenici