EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF LIVER REDOX
STATUS INDUCED BY ISCHEMIA-REPERFUSION
INJURY DURING HEPATIC SURGERY: ANALYSIS OF
HEMATIC AND TISSUTAL PARAMETERS.
Guzzetti E., Ferla F., Milani F., Accinni R.,
Aldrighetti L., Catena M., Ferla G.
Liver Unit - Dipartimento di Chirurgia
Istituto Scientifico San Raffaele
Università Vita-Salute San Raffaele
Milano
Controllo del sanguinamento intraoperatorio:
occlusione intermittente del peduncolo
vascolare epatico
Trasfusioni intraoperatorie di emazie
concentrate o plasma fresco
congelato sono associate ad un
peggioramento prognostico. 1, 2
Occlusione intermittente del
peduncolo vascolare epatico
(manovra di Pringle): chiusura con
uno strumento emostatico
dell’intero ilo portobiliare (v.porta,
a.epatica, via biliare)
1: Koobi DA, et al. Influence of transfusion on
perioperative and long term outcone in patients
following hepatic resection for colorectal
metastases. Ann Surg 2003;237:860-870
2: Wu CC, et al. Prediction and limitation of hepatic
tumor resection without blood transfusion in
cirrhotic patients. Arch Surg 1998;133:1007-1010
Danno da ischemia e riperfusione (IR)
Specie reattive dell’ossigeno
• Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da
sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di
Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica 3.
• Produzione di radicali liberi: specie reattive di
ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare
varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) 4.
• Sistema antiossidante endogeno: molecole ed
enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai
radicali liberi 5.
3: Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol 2003;284:G15-G26
4: Bayir H Reactive oxygen species. Crit Care Med 2005;33(12):S498-S501.
5: Glantzounis G, et al. The contemporary role of antioxidant therapy in attenuating liver ischemia-reperfusion
injury: a review. Liver Transpl 2005;11:1031-1047.
Glutatione (GSH)
(L-g-glutamil-L-cisteinilglicina)
• Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che può
essere ossidato e ridotto.
• Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina 6.
Glutatione Perossidasi (GPx)
H2O2
2 H2O
2 GSH
GSSG
2 NADP+ + 2H+
2 NADPH
Glutatione Reduttasi (GR)
6: Wu G, et al. Glutathione metabolsim and its implication for health. J Nutr 2004;134:489-492.
Studio Clinico Sperimentale
SCOPO: studiare le variazioni dello stato redox cellulare, indotte
dall’insulto ischemico-riperfusorio, analizzando le alterazioni
del GSH e dei suoi precursori a livello tissutale epatico e a
livello plasmatico.
PAZIENTI:
• Totale: n°43.
• Gruppo P: n° 36 (occlusione del peduncolo
vascolare eseguita)
• Gruppo NP: n°7 (occlusione del peduncolo
vascolare non eseguita – controllo)
MATERIALI E METODI:
MODALITA’ DI CAMPIONAMENTO
Campioni tissutali - prelievo di biopsie epatiche con il seguente timing:
• T1: prima della fase ischemica
• T2: dopo 10 min. di ischemia
• T3: dopo 20 min. di riperfusione
Campioni plasmatici – prelievo di 12 ml di sangue venoso con il
seguente timing:
• T1: preoperatorio
• T2: al termine dell’intervento
• T3: 1a giornata postoperatoria
• T4: 4a giornata postoperatoria
Campionamento eseguito presso l’U.F. di Chirurgia Generale Epatobiliare –
Liver Unit (HSR) in collaborazione con il Dipartimento di Chirurga
dell’Università degli Studi di Milano (H.Sacco)
MATERIALI E METODI
Campioni tissutali
• Cisteina (ridotta e totale)
• Cisteinil-glicina (ridotta e totale)
• Glutatione (ridotto e totale)
• Attività dell’enzima Glutatione perossidasi
• Attività dell’enzima Glutatione reduttasi
Campioni plasmatici
• Cisteina
• Cisteinil-glicina
• Glutatione
• Attività dell’enzima Glutatione perossidasi
• Attività dell’enzima Glutatione reduttasi
Analisi eseguite presso il Laboratorio di Biochimica Clinica –
Istituto di Fisiologia Clinica CNR (H.Niguarda)
RISULTATI:
CARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONE
Variabile
N° pazienti
Età media (range) [anni]
Sesso (maschi/femmine) [n]
Diagnosi [n]
Metastasi da neoplasia del colon
Epatocarcinoma
Neoplasie della colecisti
Iperplasia nodulare focale
Metastasi non da neoplasia del colon
Colangiocarcinoma
Emangioma
Concomitante epatopatia [n]
Fegato sano/HCV/pregressa CT
Gruppo P
36
54 (30-79)
18/18
Gruppo NP
7
54 (26-83)
4/3
17
9
2
1
2
3
2
2
2
2
1
26/2/8
3/2/2
RISULTATI:
RESEZIONI EPATICHE
Variabile
Procedura chururgica principale [n]
Epatectomia destra
Segmentectomia
Nodulectomie multiple <5
Bisegmentectomia
Epatectomia sinistra
Mesoepatectomia
Epatectomia destra estesa al IV segm.
Tipo di resezione [n]
Maggiore/Minore
Anatomica/Non Anatomica
Singola/Multipla
Gruppo P
Gruppo NP
14
6
1
7
5
2
1
2
4
1
22/14
33/3
30/6
2/5
4/3
5/2
Durata media del clampaggio (range) [min.]
39 (10-86)
-
RISULTATI:
OUTCOME PERIOPERATORIO
Variabile
Gruppo P
Gruppo NP
Perdite ematiche medie (range) [ml]
460 (100-1500) 400 (100-700)
Trasfusioni di EC intraoperatorie [U]
4
1
Indici biochimici di funzionalità epatica
Picco ALT [media(ds)] U/L
493 (427)
358 (256)
Picco AST [media(ds)] U/L
503 (405)
351 (226)
Picco bilirubina totale [media(ds)] mg/dl
1,42 (0,87)
2,06 (1,07)
Picco PT-INR [media(ds)]
1,24 (0,21)
1,17 (0,13)
Complicanze postoperatorie [n]
Fistola biliare
4
1
Insufficienza epatica
4
Versamento pleurico
2
Infezione polmonare
1
Emorragie
1
Fibrillazione atriale
1
Degenza postoperatoria media (range) [gg]
13,7 (5-66)
8,4 (6-16)
Mortalità postoperatoria
-
DATI BIOCHIMICI
Come varia la concentrazione degli
antiossidanti tiolici in seguito a danno
ischemico-riperfusorio?
RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - CISTEINA,
CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE
 Gruppo P
 Gruppo NP
Cisteina
Cisteinilglicina
4,50
m M/gr prot
mM/gr prot
35
30
25
20
15
3,50
2,50
1,50
10
1
1
2
2
3
3
tim ing
tim ing
Glutatione
 Riduzione delle
concentrazioni tissutali di
glutatione e dei suoi
precursori
80
75
mM/gr prot
70
65
60
55
50
45
40
35
30
1
2
timing
3
Come varia lo stato ossidoriduttivo degli
antiossidanti tiolici in seguito a danno
ischemico-riperfusorio?
RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI STATO REDOX DI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA,
GLUTATIONE
Gruppo P
Rapporto R/T composti tiolici
Gruppo NP
T1
T2
T3
T1
T3
Cisteina R/T
0,29
0,37
0,44
0,26
0,31
Cisteinil-glicina R/T
0,36
0,51
0,62
0,54
0,57
Glutatione R/T
0,45
0,53
0,71
0,61
0,92
 Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra forma
ridotta e totale dei composti tiolici, e soprattutto
del glutatione.
Perché aumenta la concentrazione di GSH ridotto?
RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO
REDOX DEL GLUTATIONE
ATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI
 Gruppo P
 Gruppo NP
 Lieve incremento
dell’attività della
glutatione reduttasi al
termine della fase
riperfusoria.
GR
90
85
U/gr prot
80
75
70
65
60
55
50
1
2
tim ing
3
CONCLUSIONI:
ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI
1.
Consumo di glutatione e dei suoi precursori.
2. Condizione intracellulare di stress ossidativo, con
miglioramento dello stato ossidoriduttivo del
glutatione al termine della fase riperfusoria
(mantenuta attività dell’enzima glutatione
reduttasi).
 La scarsità di glutatione potrebbe essere il
fattore limitante l’attività della glutatione
reduttasi.
RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI
CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE
 Gruppo P
 Gruppo NP
Val. riferimento
Cisteinil glicina
Cisteina
70
350
60
50
250
m M/L
Mm/ L
300
200
40
30
20
150
10
100
0
1
2
3
timing
4
1
2
3
4
tim ing
 Livelli basali preoperatori ridotti
di GSH.
 Consumo nell’immediato
postoperatorio, seguito da un
progressivo recupero.
 Alterazioni più evidenti nel
gruppo P.
RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI
ATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI
 Gruppo P
 Gruppo NP
Val. riferimento
GR
90
80
60
50
90
40
85
30
20
1
2
U/gr prot
U/L
70
 Notevole incremento
dell’attività
dell’enzima glutatione
GR
reduttasi nel
Campione tissutalepostoperatorio.
80
75
70
65
3
4
60
tim
55 ing
50
1
2
tim ing
3
CONCLUSIONI:
ANALISI SU CAMPIONI PLASMATICI
 Livelli scarsi di GSH a livello basale preoperatorio.
 Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un
progressivo incremento della concentrazione
plasmatica di GSH e precursori, e ad un
miglioramento del loro stato ossidoriduttivo
(notevole aumento dell’attività della glutatione
reduttasi).
CONCLUSIONI
1.
2.
3.
4.
Riscontro a livello preoperatorio di scarse riserve
intracellulari di glutatione.
Consumo di precursori del glutatione, che
impedisce la produzione del glutatione stesso.
Condizione intracellulare di stress ossidativo, con
miglioramento dello stato ossidoriduttivo nelle
giornate postoperatorie.
Simile trend di modifica delle concentrazioni
tissutali e plasmatiche di GSH e precursori.