Progetto lauree scientifiche
Anno scolastico 2006/07
TRASFORMAZIONI
BIOTECNOLOGICHE
CLASSI 5A & 5B
CHIMICA

Le tecniche biotecnologiche permettono di
trasformare substrati organici, generalmente
economici, in altre molecole evitando
complesse e costose sintesi per via chimica.
 Queste tecniche hanno numerosi vantaggi:
1.
Utilizzo di substrati economici
2.
Minor utilizzo di energia
3.
Produzione di sostanze di scarto
compatibili con l’ambiente
MICRORGANISMI
UTILIZZATI
 Nelle trasformazioni biotecnolgiche si
utilizzano microrganismi
opportunamente scelti e\o
geneticamente modificati (inoculo).
 I prodotti di biosintesi sono
principalmente i metaboliti primari o
secondari della fermentazione o della
respirazione del microrganismo.

L’inoculo è l’insieme dei microrganismi
selezionati necessari alla reazione volti alla
riproduzione “su vasta scala” del ceppo
microbico.

Metaboliti
sostanze che prendono parte alle reazioni
chimiche che avvengono nell'organismo oppure
che derivano da esse, si dividono in:
 Primari : sono prodotti e trattenuti
all’interno dell’organismo vivente che li
produce,sono espressi in continuo.
 Secondari: sono prodotti (sostanze
chimiche) del metabolismo che non sono
essenziali per la semplice crescita, sviluppo o
riproduzione;
FERMENTAZIONE


Il termine fermentazione indica l'ottenimento di
un composto come prodotto di trasformazione
di una sostanza di partenza (substrato) ad
opera di un opportuno microrganismo. La
fermentazione è un processo ossidativo
anaerobico svolto da organismi a carico di
molecole organiche per la produzione di
energia.
Nella fermentazione l’accettore finale di
elettroni è una sostanza organica che si riduce.
RESPIRAZIONE
La respirazione cellulare è un processo
ossidativo aerobico che permette di ricavare
molecole energetiche come ATP a partire da
carboidrati, lipidi o altri metaboliti. Quando
l’accettore finale di elettroni è l’ossigeno si
ottengono H2O e CO2 come prodotti finali.
BIOTRASFORMAZIONE

La biotrasformazione è una trasformazione di una
sostanza in un’altra tramite microrganismi sfruttando le
loro capacità enzimatiche
Vantaggi:
Svantaggi:
• Alternativa alla tecnologia
chimica
• Tempi di lavoro lunghi
• Riduzione dell’inquinamento
• Richiede totale sterilità
• Richiede una buona manualità
Obbiettivi:
• Produzione di energia
• Disinquinamento
• Giungere a microrganismi geneticamente modificati
IL TERRENO
DI COLTURA


È una fonte di nutrimento da cui il
microrganismo può trarre energia e
nutrimento.
Vengono riprodotte le stesse condizioni
nutrizionali e chimico - fisiche dell’ambiente di
provenienza del microrganismo preso in
considerazione
IL TERRENO
DI COLTURA


Questa tecnica ci permette di allevare i
microrganismi in laboratorio e di realizzare
l’isolamento di ceppi puri.
Non esiste un terreno colturale adatto a tutti i
microrganismi.
TIPI DI
TERRENO
 Terreni naturali o empirici: Ricchi di principi nutritivi
 Terreni semisintetici: Costituiti in parte da composti
chimici e in parte da sostanze naturali
 Terreni sintetici: A differenza del terreno sopra
elencato la composizione è interamente nota
 Terreni liquidi: Si utilizzano per far crescere
abbondantemente una colonia.
 Terreni solidificati: Per isolare i microrganismi fino ad
averli puri
TIPI DI
SEMINA
Premessa: in laboratorio si eseguono studi
quantitativi e qualitativi sui microrganismi e occorre che
essi siano in coltura pura, cioè che il ceppo da
esaminare sia esente da altri microrganismi.
Una coltura pura si può ottenere separando i vari
microrganismi presenti in uno stesso terreno iniziale
mediante tecniche dette di isolamento.
TIPI DI
SEMINA

Le semine si possono eseguire:

In massa, in un terreno liquido.
Per strisciamento

Sulla superficie di un Su piastra Petri
terreno solidificato.
Per spatolamento
Su slant
Per strisciamento
In un terreno solidificabile per inclusione

In massa
In un terreno solidificato per infissione
•
Tutte le tecniche sopra elencate devono essere eseguite in
spazio sterile.
COMPOSIZIONE TERRENO PER
LA BIOTRASFORMAZIONE
COMPOSIZIONE:











Terreno liquido:
n°. 5 beute (per prove di screening) da 100 ml
con 20 ml di terreno
COMPOSIZIONE: 5 g/L di Tryptone
2,5 g/L di Ey
1 g/L di Glucosio
Terreno solido:
n°.10 slant con 8 ml di terreno liquido ciascuno
COMPOSIZIONE: 5 g/L di Tryptone
0,5 g/L di Ey
20 g/L di Agar
1 g/L di Glucosio
LO SLANT


Chiamati anche tubi a becco di clarino: sono
provette dove viene solidificato in posizione
obliqua un terreno liquido(con l’aggiunta di
Agar)
Con questo tipo di preparazione si osserva
meglio il microrganismo e le sue fasi di
crescita,inoltre si presta meglio alla semina con
ansa e con ago e alla crescita di microrganismi
aerobi.
STERILIZZAZIONE
E DISINFEZIONE
 Mezzi chimici: Disinfezione : Uso di sostanze detergenti che però non
garantiscono sempre anche l’eliminazione
delle spore
 Mezzi fisici: Sterilizzazione
 In laboratorio
sono usati:
Secco (stufa)
Umido (autoclave)
- Calore
- Radiazione
- Impiego del freddo
- Essicamento
- Filtrazione
Chiusa: quando devo
garantire l’eliminazione di
organismi che resistono
ad alte temperature
Gli enantiomeri sono stereoisomeri che presentano la
stessa formula bruta, la stessa formula di struttura, ma
diverso orientamento degli atomi nello spazio.
Presentano attività ottica: una sostanza è otticamente
attiva quando, attraversata da un fascio di luce
polarizzata, ruota il piano di polarizzazione stesso.
Due enantiomeri ruotano il piano della luce polarizzata
di uno stesso angolo ma di senso opposto.
Due enantiomeri sono l’uno l’immagine speculare
dell’altro ma non sono sovrapponibili (chirali).
DUE ENANTIOMERI
HANNO:
I.
Stesse proprietà fisiche ad eccezione della attività
ottica, stesse proprietà chimiche ad eccezione della
reattività nei confronti di substrati chirali.
II.
I recettori biologici hanno delle strutture spaziali
specifiche.
III.
Per manifestare attività una molecola chirale deve
combaciare con un recettore chirale altrimenti non
avviene alcuna interazione.
COME SI
SEPARANO

In questa esperienza per separare i due enantiomeri del
feniletanolo si è ricorso ad una biotrasformazione con
un microrganismo ( bacillus stearothermophilus)
Bacillus
CH3
CH3
stearothermophilus
OH
R/S


O
CH3
+
OH
R
Questo batterio, utilizzando sistemi enzimatici chirali,
bioconverte solo uno dei due enantiomeri del
feniletanolo in acetofenone (chetone).
Per separare acetofenone e (R)-1-feniletanolo abbiamo
utilizzato la gascromatografia su fasi chirali.
CROMATOGRAFIA
₪ Questa tecnica analitica ha lo scopo di separare i
componenti della miscela sfruttando la diversa
interazione dei vari componenti con un materiale
fermo (fase stazionaria) e un materiale mobile (fase
mobile).
₪ La fase mobile è un fluido inerte sia nei confronti
della fase stazionaria che dei componenti della
miscela che deve solubilizzare i componenti della
miscela e trascinarli in una colonna in cui è posta la
fase stazionaria.
₪ All’interno della colonna i componenti della miscela
interagiscono diversamente con la fase stazionaria e
la fase mobile e conseguentemente escono dalla
colonna con tempi diversi.
CROMATOGRAFIA

Le sostanze da separare che hanno maggiore
affinità per la fase stazionaria vengono
maggiormente trattenute e escono dalla colonna
più tardi.

Il contrario invece avviene per quelle sostanze
che manifestano una maggiore affinità per la
fase mobile.
GASCROMATOGRAFIA

La gascromatografia è una particolare tecnica
cromatografica, che ha lo scopo di separare più
componenti di una miscela, sfruttando la loro
diversa affinità per una fase stazionaria ( fS )
contenuta in una colonna e con cui le sostanze
interagiscono trasportate da una fase mobile
gassosa.
GASCROMATOGRAFIA


La fase mobile è un gas che deve avere:
 Elevato grado di purezza;
 Inerzia chimica nei confronti della fS e verso i
componenti della miscela;
 Possibilmente una elevata densità (o PM) per
minimizzare il fenomeno della diffusione
molecolare longitudinale che provoca allargamento
dei picchi e quindi una diminuzione dell’efficienza;
 Compatibilità con il rivelatore;
 Basso costo.
La fase stazionaria può essere:
 Solida ( GSC )
 Liquida supportata da materiale solido ( GLC )
LE COLONNE PER GASCROMATOGRAFIA
POSSONO ESSERE DI DUE TIPI:


Colonna impaccata : - diametro interno 0.75 ÷ 4 mm
- lunghezza fino a 10 m
- la fs occupa tutto il volume interno
della colonna
- possono essere di acciaio o vetro.
Colonna capillare: - diametro interno 0.1 ÷0.75 mm
- lunghezza da 15 ÷ 100 m
- in silice rivestite da materiale plastico
di protezione
- la fs riveste solo la parete interna.
SCHEMA DI UN
GASCROMATOGRAFO
CROMATOGRAFIA SU
FASI CHIRALI
 Nel nostro caso la miscela conteneva
sostanze otticamente attive e perciò si è
utilizzata la cromatografia su fasi chirali, che
prevede la formazione di diasteroisomeri
mediante l’interazione dinamica reversibile
delle specie da separare con uno specifico
“mezzo chirale”, rappresentato in genere
dalla fS della colonna utilizzata.
 I diasteroisomeri formatisi hanno tempi di
ritenzione diversi.
Cromatogramma dei due
enantiomeri
Cromatogramma ottenuto dopo
l’azione del microrganismo:
CONCLUSIONE

Seppure il terreno di coltura sia stato realizzato attenendoci alle
metodiche operative, non riproduce le stesse condizioni
nutrizionali e chimico - fisiche dell’ambiente di provenienza del
nostro microrganismo, perciò si è verificato un piccolo
accrescimento nel terreno liquido e quasi assente in quello
solido.

In base all’esperienza acquisita nei laboratori universitari
l’enantiomero L viene completamente biotrasformato dal bacillo.
Nel cromatogramma ottenuto al termine della nostra esperienza,
sono visibili 3 picchi di cui il primo corrispondente al chetone e
gli altri corrispondenti ai due enantiomeri. Possiamo concludere
che la parziale biotrasformazione sia dipesa da una modificazione
genetica del microrganismo o da altri fattori accidentali non
facilmente identificabili.