Test - Sreening - Acondroplasia
Lezione 3
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Cos’e’ l’analisi
analisi genetica
 L’analisi individua il genotipo di individui a rischio
per ben definite patologie. Oggi possono essere
identificate anche prima della nascita piu’ di 300
malattie genetiche.
 La maggior parte sono rare e l’analisi viene fatta
solo quando c’e’ una indicazione precisa
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Cos’e’ lo screening
 Lo screening genetico si effettua su una popolazione o
su un gruppo di individui non imparentati.
 Non si possono fare screening per tutte le possibili
malattie: si effettua su una popolazione in cui una
particolare patologia ha un’incidenza significativa:
es.Tay-Sachs nei canadesi francofoni o negli ebrei
orientali. L’anemia falciforme nel bacino mediterraneo, la
talassemia.......
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Quando eseguire i test genetici I
Rischio noto di una particolare malattia
in un feto o in sospetti portatori
Se la mutazione e’ gia’ nota perche’ si e’ studiato
il precedente affetto e’ relativamente semplice.
Se la patologia e’ recessiva le mutazioni da ricercare
potrebbero essere 2
Se la mutazione non e’ nota la strategia e’ piu’
complessa e potrebbe non portare a dei risultati utili:
come per CF. In questo caso si ricorre al linkage
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Quando eseguire i test genetici
II
Screening nei neonati
La popolazione da testare e’ ben identificata
L’analisi e’ economica e rapida
E’ possibile anche nel caso degli affetti
intervenire per impedire la comparsa della
patologia: fenilchetonuria
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Quando eseguire i test genetici
III
Confermare o smentire una diagnosi clinica:
penetranza, eterogenita’ genetica, fenocopie
Identificare lo stato di portatore nel caso di patologie
ad insorgenza tardiva o di suscettibilita’ a patologie
tumorali
Confermare il coinvolgimento nella patogenesi di una
malattia di un gene candidato clonato
In futuro identificare geni che predispongono alla
comparsa di patologie complesse
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Premesse
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Premesse
Le tecniche vanno scelte caso per caso in
relazione a quello che si sa della patologia in
studio, al caso che si sta studiando, alla
struttura della famiglia in relazione al modello di
trasmissione della malattia, alla possibilita’ di
mosaicismo, al perche’ si fa la diagnosi
(conferma diagnostica, ricerca degli eterozigoti,
diagnosi prenatale....). Per una particolare
famiglia puo’ non bastare l’approccio standard e
bisogna cambiare strategia ricorrerendo a
tecniche aggiuntive.
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Quando non si e’ trovato niente di noto
Quando si sono testate le mutazioni gia’ note e non si e’ arrivati
a definire la presenza della mutazione, prima di ricorrere al
sequenziamento vero e proprio di tutto il gene, si puo’ ricorrere a
tecniche per evidenziare differenze fra la sequenza normale e la
mutata, anche senza conoscerne la sequenza (SSCP, DDGE....)
Il principio su cui si basano e’ quello per cui una variazione anche di
una sola base modifica la conformazione del DNA in condizioni
sperimentali definite,o evidenziano grosse alterazioni della sequenza
(delezioni, duplicazioni...)
attenzione pero’ a variazioni polimorfiche
 Polimorfismo: variazione la cui frequenza sia maggiore di 0,01(1%)
Eterozigosi media per il DNA genomico umano:~ 0,0037 (0,37%). Cio’
significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse
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Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking)
Non si puo’ fare l’analisi diretta della mutazione: gene non clonato o non si
sono individuate mutazioni nella sequenza del gene
Prerequisiti: 1) Malattia mappata per poter identificare in banca dati marcatori
il piu’ strettamente associati. 2) la struttura della famiglia e la disponibilita’ dei
campioni devono permettere di ricostruire la fase.
Tre fasi:
1) Distinguere i due cromosomi(aplotipi) del(i) gentore(i) che possono aver
trasmesso il gene malattia
2) Determinare la fase
3) definire quale aplotipo ha ereditato il probando dai genitori
Questa logica si applica a fenotipi con qualunque tipo di
ereditarieta’. L’informativita’ dei marcatori non e’ piu’
un problema: ci sono oggi microsatelliti altamente
informativi mappati su tutto il genoma. Il limite piu’
grosso e’ dato dalla struttura della famiglia
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Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking)
Patologia dominante (espressivita’ variabile,
penetranza risotta, insorgenza tardiva)
I1
2) identificato un marcatore
per cui II3 e’ eterozigote
I2
II4
II3
2-1
III1
III2
1) richiesta del test
3) identificare con quale allele
segrega il fenotipo (fase)
I1
I1
I2 2-4
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III2
I2 2-4
II4
1-3
II3
2-1
II4
II3
2-1
III1
4) identificare il genotipo di III2,
analizzando lei e II4
Quali sono i risultati
possibili?
III1
III2
Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking)
Patologia dominante (espressivita’ variabile,
penetranza risotta, insorgenza tardiva)
Risultati possibili
I1
I2
2-4
II3
III2: 2-1 o 2-3 NON e’portatrice,
perche’ in questa famiglia la regione mutata
e’ identificata dall’allele 1
II4
2-1
III1
1-3
III2
III2: 1-1 o 1-3 E’ portatrice, perche’ in questa famiglia la
regione mutata e’ identificata dall’allele 1
ATTENZIONE: e’ importante la segregazione all’interno della famiglia e non
il particolare genotipo: se III2 avesse 2-1 cioe’ lo stesso genotipo della madre
malata, non sarebbe portatrice
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Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking)
L’informativita’ dei marcatori non e’ piu’ un problema: ci sono oggi microsatelliti altamente informativi
mappati su tutto il genoma il limite piu’ grosso e’ dato dalla struttura della famiglia
Stesso fenotipo recessivo e segregazione in 4 famiglie diverse
2-1
2-1
Impossibile il test perche’
non c’e’ il DNA di riferimento
dell’affetto
1-1
2-1
2-1
2-1
50%N, 50% affetto:non si puo’ definire di chi
sono gli alleli ereditati dal feto. L’allele 2 del feto
e’ lo stesso della sorella?
2-1
2-2
2-1
Nessuna previsione come prima
Normale 1-1
Portatore 2-1
2-1
2-2
Affetto 2-2
L’errore diagnostico puo’ venire dalla ricombinazione che deve essere
la piu’ bassa possibile
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Diagnostica I
 le informazioni sulle malattie sono reperibili oltre che come PDF anche
direttamente al sito http://www.genetests.org: cliccare su laboratory directory
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nella
barra
il sito
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il sito
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il sito
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Acondroplasia
Velazquez
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Acondroplasia I
Il gene coinvolto in questa patologia e’ FGFR3 (Fibroblast growth factor
receptor-3), che mappa in 4p16.3 (telomero del cromosoma 4), contiene
19 esoni, e’ lungo 16.5 Kb ed e’ l’unico le cui mutazioni siano state
collegate all’acondroplasia.
Il recettore ha 3 domini Ig-like, un dominio transmembrana e un dominio
citoplasmatico tirosinochianasico
Sembra che il ruolo fisiologico di questo recettore sia quello di controllare
negativamente la proliferazione e il differenziamento nel centro di
ossificazione. Le mutazioni avrebbero come risultato di mantenere sempre
attivo il recettore e quindi il loro effetto si puo’ configurare come aumento
di funzione
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considerazione importante
Sembra che il ruolo fisiologico di questo recettore sia quello di controllare negativamente la
proliferazione e il differenziamento nel centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero come
risultato di mantenere sempre attivo il recettore e quindi il loro effetto si puo’ configurare
come aumento di funzione
Bisogna sempre ricordare che la dominanza attiene al fenotipo e quindi
e’ l’effetto della mutazione sulla funzione del prodotto che provoca la
dominanza del fenotipo mutato sul wildtype. Quindi l’effetto della
mutazione dipende da:
quale e’ la funzione del wt: e’ sensibile alla dose sia in piu’ che in meno?
e quindi: la mutazione provoca un aumento o una diminuzione dell’attivita’
del prodotto?
Questo vale per tutti i geni e i loro prodotti !!!
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Acondroplasia II
L’acondroplasia e’ una patologia originata ad un anormale sviluppo osseo. E’
una patologia autosomica dominante, oltre l’80% degli affetti hanno
genitori con statura normale e sono originati da una mutazione de novo,
quindi il rischio di ricorrenza e’ basso (attenzione al mosaicismo germinale)
Nel caso di una coppia in cui uno dei partner sia affetto, il rischio di
ricorrenza e’ 50%, se entrambi sono affetti: 25% non affetti, 50%
affetti, 25% letali per l’omozigosi.
Sembrerebbe collegata con aumentata eta’ paterna, proprio per il
relativamente alto tasso di nuove mutazioni. Il mosaicismo germinale
sembra essere la causa delle rare famiglie con ricorrenza
Perche’ la diagnosi molecolare?
per confermare un sospetto diagnostico
per una diagnostica prenatale ( mosaicismo germinale)
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Acondroplasia III
Analisi di mutazioni note: sono note 2 mutazioni patogenetiche che
vengono ritrovate (una sola!) nel 99% degli affetti. Entrambe sono a
carico del codone 380 al nucleotide 1138 e provocano, a causa della
sostituzione della prima base della tripletta, la sostituzione di una glicina
con una arginina nel dominio transmembrana G380R.
Nel 98% e’ una transizione G>A
nell’1% e’ una trasversione G>C
il restante 1% puo’ essere dovuto ad altri alleli rari:
G>T codone 375 glicina>cisteina
A>G codone 650 lisina> glutamina (letale:nanismo thanatoforo)
.......
Per tutte la tecnica e’ la ARMS o analoghe: la sequenza wt e mutata
sono note. E se non ci sono le mutazioni note? e si deve fare una diagnosi
prenatale?
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Test per mutazioni note
Ricerca di mutazioni puntiformi:
ARMS
(Amplification Refractory Mutation System):
si eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo IN 2 PROVETTE
in una i primer sono entrambi per la sequenza normale,
nell’altra un primer e’ un ASO specifico per la mutazione.
Si ha la banda di amplificazione solo se entrambi i primer si appaiano.
Di solito il test e’ multiplex utilizzando primer che permettano di vedere
piccole variazioni nella corsa elettroforetica.
By NA
1. I multiplex
Allele A M
Allele B N
Allele C N
DF508N
Allele D N
Allele E N
Allele A N
Allele B N
Allele C N
DF508N
Allele D M
Allele E N
CFTR
A m
B m
C m
DF508
n
Contr
D m
E m
DF508 M
Contr.
PCR
A M
DF508
n
Contr,
D M
Contr.
AM
DM
D508N
Contr.
Reazione 1
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Reazione 2
Reazione 1
Reazione 2
1
2
Acondroplasia IV
Sequenziamento tenendo presente che se si trova una mutazione:
Mutazione mai descritta in letteratura, ma che potrebbe essere
patogenetica (il meccanismo di azione del prodotto e’ noto): e’ presente
in altri soggetti sani della famiglia?
Mutazione mai descritta in letteratura, con effetto ignoto sulla
funzionalita’: e’ presente in soggetti sani della famiglia?
Mutazione mai descritta in letteratura, ma il cui effetto si ritiene
innocuo sulla funzionalita’: e’ presente in soggetti sani della famiglia?
Mutazione descritta in letteratura, il cui effetto e’ accertato essere
innocuo sulla funzionalita’ (come?)
By NA
Acondroplasia V
Sequenziamento: si e’ risposto SI a tutte le domande precedenti, quindi
non si e’ trovato niente di chiaramente patogenetico. Che vuol dire?
Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione ad un altro locus,
Diagnosi errata o il prodotto del secondo ipotetico locus interagisce
con il primo e quindi il fenotipo e’ uguale
Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione non visibile
perche’ si manifesta durante la maturazione dell’RNA.
E quindi che faccio?
Nel caso dell’acondroplasia l’ecografia prenatale mi aiuta e non e’ il caso
di ricorrere al linkage perche’ non esistono portatori “silenti”: la
penetranza e’ totale e non c’e’ espressivita’ variabile.
By NA
Acondroplasia VI
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Acondroplasia VII
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