Espressione proteine (farmaci)
ricombinanti
• studiare i rapporti struttura/funzione
• produrre enzimi a scopo industriale
• conferire a piante o animali nuove
proprietà
• per PRODURRE FARMACIRICOMBINANTI (PROTEINE)
Pc lacI
Pi
O
Z
Y
A
mRNA policistronico
Si lega
all’operatore
lacI
Induttore
(lattosio o
IPTG)
Pc= promotore costitutivo
Lac I= gene regolatore
-previene la trascrizione
-riconosce e lega la piccola molecola di induttore.
Pi= promotore inducibile
O=operatore
Z,Y,A= geni strutturali (galattosidasi, permeasi, transacetilasi)
• Al sistema descritto si associa inoltre un sistema definito di
repressione da glucosio.
• In presenza di abbondanti quantità di glucosio e lattosio E.coli
metabolizza esclusivamente glucosio, ma quando il livello di
glucosio si abbassa vi è una risposta metabolica complessa che
prevede l'attivazione dell'adenilato ciclasi (sensore di bassi livelli di
glucosio) e conseguente aumento di cAMP.
• cAMP si lega ad una proteina (CRP) cAMP receptor protein. Il
complesso cAMP-CRP lega con alta affinità una sequenza di DNA a
-68 -55 e il complesso con il DNA in questo punto facilita l'aggancio
dell'RNA polimerasi che forma un legame più stabile con il
promotore
Vettore di espressione
•
•
•
•
•
•
•
gene lac I,
gene lac Z’ (solo la porzione N-terminale di b-galattosidasi) che può essere
indotto da IPTG
polilinker a valle del promotore lac e dopo poche basi di lac Z’
La sola porzione N-ter di b-galattosidasi non è funzionante, così come la
sola porzione C-term. Ma se le uniamo e induciamo l’espressione, la
proteina che si ottiene diventa funzionante (peptide di b-galattosidasi
funzionante).
Anche mutazioni nel gene lac Z dei batteri daranno origine a una bgalattosidasi non funzionante.
Se in questo batterio introduciamo un plasmide che esprime il peptide lac
Z’, questo potrà produrre b-galattosidasi e complementare il batterio senza
galattosidasi funzionante (complementazione).
Mettendo un substarto cromogeno (X-gal) in grado di essere idrolizzato
dalla galattosidasi, si potrà verificare praticamente l’azione delle
galattosidasi ottenuta mediante complementazione.
Promotore/operatore
MCS
Shine-Dalgarno
Terminatore
TAG
lacI
oriC
Ap
ori
SISTEMA pET
• Il promotore lac non è molto forte. Per produrre proteine
ricombinanti si preferisce usare altri vettrori ingegnerizzati, come il
vettore pET, basati sull’operone lac.
• Questo vettore utilizza il promotore della T7 RNA polimerasi di fago,
invece del promotore lac. Questo promotore è molto più forte del
promotore lac e riconosce in modo specifico solo la T7 RNA pol.
• Il sistema pET richiede che anche l’ospite batterico sia
geneticamente ingegnerizzato (E.coli BL (DE3). Questo ceppo ha
integrato nel suo cromosoma il gene della T7 RNA polimerasi di
fago. La T7 RNA pol nel genoma dell’ospite è costruito in maniera
tale che sia sotto il controllo del promotore e operone lac. Pertanto,
l’induzione con IPTG provoca la sintesi di T7 RNA pol, che va a
legarsi al suo promotore nel plasmide di espressione dando luogo
alla sintesi della proteina
• Il prodotto proteico ottenuto dalla
trascrizione di un cDNA inserito in un
vettore di espressione si può ottenere in
procarioti:
•
come aggregato proteico
insolubile (corpi inclusi )
•
come proteina fusa,
•
come proteina nativa integra.
Purificazione
• Le proteine possono essere separate
secondio la carica, l’idrofobicità, l’affinità
per alcune molecole, ecc.
• I sistemi cromatografici attualmente
disponibili sono diversi. Il sistema
cromatografico più utilizzato per separare
le proteine ricombinanti è la
cromatografia per affinità.
5’
3’
-CATCATCATCATCATCAT- 3’
-GTAGTAGTAGTAGTAGTA- 5’
-His- His- His- His- His- His-
- O
O
N
Expressed protein with N- or
C-terminal His tag
Ni 2+
N
Ni-NTA matrix
O
N
N
O
-O
- O
N
NH2-H-H-H-H-H-H-D-D-D-D-K-XXXXXXXX
NH2-XXXXXXXXXXXX
Proteina senza extra sequenza
Espressione in cellule eucariotiche
(cenni)
• La cellula eucariotica è l’ambiente naturale per
esprimere proteine eucariotiche.
• Sono disponibili oggi una grande varietà di sistemi di
espressione eucariotici.
• Questi sistemi si basano sulla capacità di fare esprimere
in cellule eucariotiche in coltura una proteina codificata
da un gene clonato nell’opportuno vettore di
espressione.
• Il sistema di base non è diverso da quello utilizzato per
esprimere le proteine nei batteri o nel lievito. Tuttavia
sono richiesti requisiti particolari propri degli eucarioti
• Il primo problema è quello di introdurre il DNA
ricombinante nelle cellula eucariotica ospite.
Virus del vaiolo del vaccino
•
•
•
Virus del vaiolo del vaccino o virus vaccino (Vaccinia virus). Questo
virus ha un genoma di soli 184 kb e può ospitare inserti abbastanza grandi.
Si replica nel citosol della cellula ospite senza entrare nel nucleo ed ha la
capacità di infettare un largo spettro di cellule.
Una caratteristica importante di questo virus è la codificazione di una
propria RNA polimerasi e di enzimi propri che provvedono ad aggiungere il
cap e la coda di poli-A. Ha un’altissma efficienza di infezione (circa 100%)
al punto che la sintesi proteica della cellula ospite viene ridotta quasi a zero.
Metodo: la cellula viene infettata con 2 ceppi ricombinanti. Un ceppo porta
il gene della T7 RNA polimerasi sotto il controllo di un promotore tardivo del
virus P7.5, l’altro ceppo porta il gene che vogliamo fare esprimere sotto il
controllo della T7 RNA polimerasi. Le cellule infettate con il primo ceppo in
poco tempo (3 ore) producono notevoli quantità di T7 RNA polimerasi, che
va a legarsi al suo promotore nel ceppo 2, dando luogo alla produzione di
notevoli quantità di proteina. La proteina si acculula per 24-48 ore e può
essere facilmente identificata disponendo dell’anticopro opportuno
Ceppo 2
Ceppo 1
P7.5
T7
Gene
Pgene 10T7 gene
esog
coninfezione
RNA polimerasi
Proteina esogena
Characteristics
E. coli
Yeast
Insect cells
Mammalian
cells
Cell growth
rapid (30 min)
rapid (90
min)
slow (18-24 h)
slow (24 h)
Complexity of growth medium
minimum
minimum
complex
complex
Cost of growth medium
low
low
high
high
Expression level
high
low - high
low - high
low moderate
Extracellular expression
secretion to
periplasm
secretion to
medium
secretion to
medium
secretion to
medium
Protein folding
refolding
usually required
refolding
may be
required
proper folding
proper
folding
N-linked glycosylation
none
high
mannose
simple, no
sialic acid
complex
O-linked glycosylation
no
yes
yes
yes
Phosphorylation
no
yes
yes
yes
Acetylation
no
yes
yes
yes
Acylation
no
yes
yes
yes
gamma-Carboxylation
no
no
no
yes
Posttranslational
modifications
A prescindere del sistema di espressione…
Stadi del processo
•
•
•
•
•
Isolamento del gene di interesse
Introduzione nel vettore di espressione
Transformazione nelle cellule ospiti
Crescita delle cellule in un fermentatore
Isolamento e purificazione della
proteina
• Formulazione del prodotto proteico
Vantaggi
• Caratteristiche dei farmaci prodotti con la
tecnologia del DNA ricombinante:
• Sicurezza
• Perfettamente uguale a quella naturale
• Grandi quantità
Coltura cellulare piccola scala (1 Liter)
• L’espressione si fa
avvenire in colture cellulari
da 1-2 litri
Coltura batterica e
incubatore (pilota)
E. coli come produttore di proteine terapeutiche
• Genetica batterica bene caratterizzata
• Alti livelli di espressione
Biopharmaceutical
-Interferon
Level of expression
(% of total cellular protein)
25%
Insulin
20%
Interleukin 2
10%
Human growth
hormone
5%
Table 3.10 from Biopharmaceuticals, Ed. G. Walsh 1998
Test
• Test chimici e biologici:
– Misura dell’attività della
proteina ricombinante
– Conferma che è
identica a quella
naturale umana
• Test sugli animali per
essere sicuri che non è
tossica ed è efficace
Coltura su larga scala:produzione industriale
(fino a 12,000 Litri)
• Dopo che la proteina è stata
testata essere sicura e
funzionante, si passa alla
produzione su grandi quantità
• Le cellule ospiti sono cresciute
in grandi fermentatori
– Le condizioni di crescita sono
ottimizzate per dare grandi
quantità di proteina a costi bassi
Recupero del prodotto,, Formulazione,
Controllo di qualità
• Un passaggio cruciale è la purificazione
affinchè mantenga la sua funzionalità e
possa essere sottoposta a rigorosi
standard clinici di qualità
• Importanti sono anche le condizioni di
conservazione affinchè mantenga la sua
efficacia biologica.
Ultima tappa:
Nuovo prodotto nel mercato
Ripercorriamo la storia dell’insulina……
1921:
Dr. Frederick Banting and Charles Best isolate insulin and use it to treat diabetic dogs.
1922: At the age of 14, Leonard Thompson becomes the first human being to receive insulin.
1923: Eli Lilly and Company markets Iletin® (animal source insulin), the first commercially
available insulin.
Insulina
ricombinante
1950s: Amino acid sequences for several species of insulin are described.
1960s: Complete chemical synthesis of insulin is achieved. Proinsulin is discovered. Purity
of insulin is improved. X-ray crystal structure of insulin is established.
1980 Insulina ricombinante perfettamente uguale a quella naurale
•
Prime preparazioni in ambiente acido instabili
– deaminazione N A21
– Perdita di efficacia
•
Formulazioni neutre: aggiunta di Zn
– Strutture esameriche
– Picco attività 2-3 ore (durata max 6-8 ore)
– Ritardo di azione (dissociazione dell’esamero nei costituenti dimeri e/o
monomeri)
•
Progettazione di analoghi monomerici per una risposta più naturale all’aumento postprandiale della glicemia
•
Modificazione delle proprietà autoassociative dell’insulina per favorire le specie
monomere e minimizzare il ritardo dell’azione
Analoghi insulina
A-catena
H2 N
G
I
V
10
E Q
C C
S
T
I
20
C
S
L
Y
Q
L
E
N
Y
10
F
H2 N
V
N Q
H
L
S
C G
H
C N
Humaninsulin
COOH
20
L
V
A
E
L
Y
L
V
30
C G E
R G
F
F
Y
T
P
K
T
COOH
B-catena
Insulina LysB28PROB29
10
E Q
H2 N
G
I
V
H2 N
F
V
N Q
T
S
C G
S
C C
I
20
C
S
L
Y
Q
L
E
N Y
L
V
E
A
L
Y
L
V
10
H
L
H
C
N
Insulin lispro
COOH
20
C G E
30
R G
F
F
Y
T
K
P T
COOH
Inversione di due aminoacidi nella porsione C-terminale della catena B
Provocano una ridotta tendenza ad autoassociarsi rispetto all’insulina naturale
L’insulina LISPRO inizia ad agire dopo 15 minuti e raggiunge il picco
dopo 1 ora
Insulin glargine (Lantus; Aventus Pharma) : inserimento di
due arginine all’espremità C terminale della catena B (B31,
B32) e sostituzione della glicina A21
Auemnto del punto isoelettrico; precipitazione dell’insulina
nel sito di iniezione e assorbimento protratto nel tempo.
.
10
H2 N
G
I
V
E Q
C C
T
S
I
20
C
S
L
Y
Q
L
E
N Y
10
H2 N
F
V
N Q
H
L
G
V
E Q
H
L
C C
T
S
V
30
E
A
L
Y
L
V
C G E
C
S
L
Y
Q
L
E
10
H2 N
I
I
F
V
N Q
H
L
C G
S
H
R G
F
F
Y
T
20
N Y
10
H2 N
Insulin glargine
COOH
20
S
C G
C G
C
N
P
K
T
R R
Insulin aspart
COOH
20
L
V
E
A
L
Y
L
V
C G E
COOH
30
R G
F
F
Y
T
D K
T
COOH
VACCINI
Alcune proteine sono prodotte mediante animali
Transgenici.
Un organismo transgenico contiene nel suo patrimonio
genetico un gene estraneo alla sua specie.
ANIMALI TRANSGENICI
• Per animali transgenici si intendono
quegli animali ottenuti attraverso una
manipolazione del genoma, inserendo
uno o più geni, appartenenti alla stessa
specie, o più spesso ad altre specie.
1- MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI
• Induzione di superovulazione nelle femmine
• Accoppiamento
• Raccolta oociti fecondati
• Iniezione con micropipetta del DNA esogeno (DNA di
interesse) nel pronucleo maschile dei singoli oociti
• Reimpianto degli oociti che sopravvivono negli ovidotti di
altre femmine e lasciati sviluppare fini al termine della
gravidanza
•
Eventi:
– Integrazione a caso del DNA iniettato nel DNA cromosmico (evento
unico)
– I siti di integrazione contengono copie multiple del transgene
integrato (concatameri testa-coda)
– Trasmissione alla progenie con modalità mendeliane ( se è integrato
nello zigote, verrà trasmesso al 50% della progenie)
Controllo per PCR la presenza del DNA esogeno
I cloni di DNA introdotti
vanno a integrarsi in corrispondenza
di incisure nel DNA cromosomico,
formando dei transgeni
IMPIEGO DELLE CELLULE STAMINALI IN
COLTURA
• Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti,
infatti possono dare origine a cellule di tessuti
differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla
massa cellulare interna della blastocisti(cellula
embrionale indifferenziata) e mantenute in
coltura in presenza di cellule o fattori che ne
impediscono il differenziamento. In queste
condizioni le cellule ES mantengono intatta la
loro capacità di differenziarsi in modo
appropriato in qualunque tessuto, una volta
reintrodotte in un embrione
TAPPE del PROCESSO:
•
Le cellule staminali che hanno integrato nel loro genoma il DNA
ricombinato, vengono iniettate in un embrione isolato in stadio
precoce di sviluppo.
•
L’embrione precoce, composto parzialmente da cellule ES, viene
introdotto nell’utero di una femmina pseudogravida.
•
Il topo “chimera” che si sviluppa da questo embrione conterrà alcune
cellule somatiche portatrici del gene alterato e conterrà anche cellule
della linea germinale che portano il gene modificato.
•
Il topo “chimera” verrà incrociato con un topo normale e alcuni
discendenti (2 su dieci) avranno un gene modificato in tutte le loro
cellule ( eterozigosi).
•
Incrociando tra loro questi topi portatori del gene modificato si ottiene
qualcuno dei discendenti contenente 2 geni alterati in tutte le sue
cellule (omozigosi ).
•
Se l’alterazione genica originale inattiva completamente la funzione
genica si avranno allora dei topi ad “eliminazione” (Knock-out) cioè
ceppi di topi che hanno un certo gene inattivato definitivamente
TECNICA: IMPIEGO DELLE CELLULE STAMINALI IN COLTURA
• Isolamento della blastocisti
• Coltivazione all’esterno delle cellule interne (ES)
• Modificazione delle cellule mediante inserimento di DNA esogeno
• Reinserimento delle cellule modificate nella blastocisti di un altro
ceppo
• Reimpianto in una madre adottiva
• Gravidanza: Chimera: due popolazioni di cellule
• Il reincrocio delle chimere può produrre topi eterozigoti per la
modificazione genetica
• Il successivo incrocio di mutanti eterozigoti può produrre omozigoti
Proteine farmacologiche prodotte con animali
transgenici
Protein
product
Therapeutic use
Human factor IX
Hemophilia B
Tissue
plasminogen
activator
Interleukin 2
Thrombolitic agent
Urokinase
Thrombolic agent
1-antitrypsin
Some forms of emphysema
Immune modulator
Recuperare la proteina dalle urine
Anticorpi
• Lo sviluppo delle conoscenze sugli anticorpi
derivanti dalla biologia molecolare ha dato un
notevole impulso alla produzione di anticorpi
ingegnerizzati mediante la tecnologie del DNA
ricombinante. In particolare è stato possibile
realizzare anticorpi chimerici in cui le proprietà
utili di legame dell’antigene di una molecola
anticorpale di una specie vengono inserite
geneticamente sulle regioni costanti degli
anticorpi di una specie differente.
Fattori di crescita
•
•
•
•
•
•
•
Descrizione
•
•
•
•
•
•
Ricombinanti
Nome
Filgrastrim Lenograstim Nartograstim
Molgramostim Sargramostim
Aa
175 (N-Met)
174
174
128
127 (23)
Glicosil. NO
O-glicosil No
No
N-glicosil.
Sistema
Espressione E.coli Ov. cric E. coli E.coli
lievito
G-CFS
Endogeni
Cromosoma
Aminoacidi
Glicosilazione
PM
17
174 (177)
O-glicosilazione
18,6 (20)
GM-CFS
5
127
N- O-glicosilazione
1.7
Epo
•
•
•
•
•
Descrizione
EPO (eritropoietina)
Endogena
Cromosoma 7
Aminoacidi
165 (2 ponti disolfuro, 3 catene legate all’N e 1
legata a O) Glicosilazione
O-glicosilazione (proteina attiva solo se
glicosilata)
• Ricombinanti
• Nome
Epoietin alfa
• Sistema
• Espressione
ovaio di criceto
Epoietinum alfa
Interferoni
• Interferoni, dotati di attività antivirale e antitumorale.
• Scoperti nel 1957, sono proteine prodotte dalla maggior parte delle
cellule di tutti i vertebrati quando adeguatamente stimolate, ed
hanno un'azione specie specifica
• La quantità prodotta nell'organismo umano in condizioni normali è
così bassa da rendere impensabile ottenerli per estrazione per
qualsiasi applicazione pratica in campo terapeutico.
• A partire dai primi anni'80 invece, i geni sono stati clonati ed è
stato possibile la produzione di queste proteine su larga scala. In
terapia si sfruttano in particolare le loro attività antivirale e
antitumorale. Nel trattamento dei tumori, gli interferoni sembrano
arrestare la proliferazione delle cellule cancerogene, e in molti casi
si osserva una riduzione della massa tumorale.
• Come antivirale, gli interferoni sono impiegati nella terapia
dell'epatite B e C.
Fattori di coagulazione
• Alcuni dei fattori coivolti nel complesso prcesso di coagulazione
sono oggi prodotti su larga scala facendoli espimere in un sistema
eterologo, soprattutto eucariotico.
• I geni dei fattori VIII e IX sono stati clonati ed espressi in cellule di
mammifero. Alcune di queste proteine si possono anche modificare.
A questo proposito, un esempio è cosituito dall’ attivatore tissutale
del plasmimogeno(tPA), un fattore trombolitico.
• Il gene è stato clonato ed espresso in cellule di mammifero
mediante l’amplificazione genica in cellule trattate con metotrexato.
• Spesso la molecola è taglitata a dare una forma in due catene. Si
cerca di capire la funzione dei vari domini in modo tale da produrre
proteine mirate e più efficaci. Per esempio il prodotto, noto come
Rapylisin, manca del dominio finger, di un kringle e dell’EGF.
Rapilysin® (Reteplase)
1
N
H2
FINGER
1
NH2
EGF
527
COOH
SERIN
PROTEASE
355
CO
OH
SERIN
PROTEASE
Si tratta di una proteina di 522 amino acidi con 17 ponti disolfuro,
in cui si possono individuare diverse regioni:
un dominio finger all’N-ter,
un dominio epidermal growth factor (EGF)
due strutture ad anello, dette kringle,
un dominio serina proteasico all’estremità C-ter (figura 163).