Biologia Molecolare
Sequenziamento dei genomi
Il pirosequenziamento
Il pirosequenziamento può essere
automaztizzato grazie all’utilizzo di una
tecnologia con micropozzetti.
Un pozzetto ha il volume inferiore a 100
pl
In un vetrino 6x6 cm possono essere
contenuti più di un milione di pozzetti.
Il pirosequenziamento può determinare
sequenze più corte rispetto al metodo di
Sanger ma è possibile parallelizzare il
processo perottenere globalmente
sequenze molto più lunghe
Il pirosequenziamento
Il pirosequenziamento si basa sull
apossibilità di rilevare la luminescenza
emessa dalla luciferasi che viene
attivata (per produzione di ATP) da una
reazione accoppiata alla sintesi del
DNA.
- Il primer si lega allo stampo e viene
incubato con: DNA polimerasi, ATP
solforilasi, luciferasi e luciferina, apirasi,
dNTP, adenosin 5’ fosfosolfato (APS)
-nucleotidi trifosfato complementare alla
prima base dello stampo viene
incorporato dalla polimerasi. Viene
rilasciato pirofosfato (PPi)
-In presenza di APS, la solforilasi
converte stechiometricamente il PPi ad
ATP.
La luciferasi utilizza l'ATP per produrre
(tramite la conversione della luciferina
ad ossiluciferina) luce.
Strategie di sequenziamento
Annotazione delle sequenze genomiche
Open Reading Frame:
-Presenza dei codoni di stop
-Codon usage