Lezione venerdì 22_XII_=&
transgenia
Condizioni di funzionamento
Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al
momento giusto e nel posto giusto
Ci sono linee di topi transgenici che esprimono Cre nelle cellule
epatiche, oppure nel sistema nervoso centrale SNC o altri sistemi
Sono state fatte proteine di fusione con il dominio mutato di legame al
ligando (ligand binding domain LBD) dell’ormone degli estrogeni, in
modo che la ricombinasi sia confinata nel citoplasma finche’ non viene
somministrato l’ormone sintetico che riconosce il recettore e fa
traslocare la proteina di fusione con la ricombinasi nel nucleo dove
induce la delezione del frammento incluso tra i due siti LoxP
(vedi esempio della figura precedente)
CRE LOX
Analisi del sistema CRE-LOX per topi transgenici con “Gene Targeting”
sito e tempo specifici.
(Methods 24 , 2001, pag 71-80) D.Metzger e P.Chambon
- limitazioni del Gene targeting : l’assenza della funzione colpita
(targetet) da mutazione durante le fasi di sviluppo puo’ risultare letale
precludendo lo studio di funzioni possibili negli stadi iniziali e successivi
a quello letale.
- molti geni svolgono funzioni multiple in vari tipi di cellule durante
l’ontogenesi e fase postnatale (pleiotropici), questo provoca fenotipi
complessi e complica l’individuazione di cellule anomale prodotte da
fenomeni con piu’ cause.
-l’effetto di una mutazione puo’ essere compensata durante lo sviluppo
manca il fenotipo alterato nell’animale adulto.
-Per famiglie di geni si devono mutare piu’ geni della stessa famiglia per
prevenire la ridondanza funzionale di espressione che preclude
l’identificazione di una funzione di un componente della famiglia genica.
Geni pleiotropici
- Definire una funzione di un gene membro di una famiglia puo’ essere
ancora piu’ complicato quando la famiglia e’ coinvolta in un sistema
pleiotropico di un pathway di segnali come i recettori per l’acido
retinoico o FGF.
- Altri effetti confondenti il knock-out di un gene possono essere il
rischio di danno sulla fertilita’e disordini sistemici.
- In tutti questi casi sara’ problematico determinare la funzione di un
gene in una frazione di cellule ad un certo momento della vita del topo.
- inoltre nel caso di modelli animali di patologie umane con mutazioni
somatiche come il cancro
- Quindi la necessita’ di avere un metodo con l’inattivazione
condizionale di un gene e’ molto forte
Sono state sviluppate strategie per avere gene-targeting condizionale in
topo basato su cellule tessuto-specifico o espressione inducibile sito
specifica del gene della ricombinasi CRE del fago P1.
CRE-LOX ed RNA interference condizionale
Metodi per interferire con l’espressione di un gene: “stable suppression of
gene expression by RNAi in mammalian cells” P.N.A.S. vol.99 n.3 pp 1443-8 P.J.Paddison et al.
- mutagenesi, mutazioni termo sensibili(condizionali), soppressori
- knock out per ricombinazione
- anticorpi contro la proteina (prodotti da un vettore)
- RNA antisenso trascritto da un vettore
- oligo antisenso
Questi metodi hanno il difetto di non essere sempre applicabili ai sitemi eucarioti; in
certi casi non sono regolabili. L’RNA antisenso per funzionare deve essere aggiunto in
dosi massicce, oppure deve essere trascritto dentro la cellula, ma il funzionamento della
interferenza e’ legata al sistema Dicer, cioe’ ad un pathway enzimatico che riduce
l’RNA specifico del messaggero in frammenti.
E’ stato fatto un esperimento sfruttando il metodo CRE Lox per produrre
un RNA a doppio filamento per bloccare l’enzima Dicer stesso
Soppressione stabile dell’espressione genica tramite RNA
interference in cellule di mammifero
Sistema cellulare di
difesa antivirale
dimerizzazione
PKR
fosforilazione
Blocco non
specifico della
traduzione
EIF2
(kinasi)
dsRNA
esogeno
(~ 500 bp)
attiva
Cofattore per la ribonucleasi
non - specifica (Rnasi L)
2’- 5’ oligodenilato
polimerasi
pcDNA3
P
GFP
ZEO
r
L
GFP
L
ZEO r
Gene per la resistenza alla
zeocina;
L Lox P;
GFP
Le prime 500 bp codificanti di
enhanced gr. fluor. prot. EGFP;
P
Promotore di
citomegalovirus;
Modello per interferenze con Cre-Lox
P
GFP
ZEO
r
L
GFP
L
Ricombinasi CRE
P
GFP
ZEO
r
ZEO
L
GFP
L
r
dsGFP
Rapporto FF:REN
Espressione di CRE
Riduzione di 10 volte dell’espressione di FF in
cellule trasfettate con i due plasmidi FF/REN
FF = firefly luciferase
REN = renilla luciferase
ds = double strand
ss = single strand
as = antisense
Lezione 17-18 OrgTransgenici 19-1-06
La selezione tramite incroci ha prodotto organismi innaturali
almeno quanto gli organismi transgenici.
Per quanto riguarda la trasmissione orizzontale di
informazione genetica ci sono prove che sia avvenuta per via
naturale ed il pericolo che avvenga con geni esogeni a specie
diverse che ne sono privi esiste. Ma si deve sapere se i geni
che si usano possono creare rischio.
Sicuramente il criterio di cautela è il più sicuro.
Le stesse preoccupazioni sono state giustamente poste
quando iniziarono i clonaggi con vettori di espressione usando
batteri e reistenze ad antibiotici. Sono nati i laboratori a
contenimento negativo da cui non possono uscire batteri
ricombinanti.
Organismi trangenici
Dopo l’esperienza con i procarioti è stato possibile fare
organismi transgenici con organismi eucariotici. La difficoltà non
era sulla complicazione della manipolazione di organismi
pluricellulari, ma solamente tecnici. Cioè la manipolazione del
DNA è sempre la stessa, il problema è veicolarlo ed integrarlo
nei genomi. A differenza dei batteri non ci sono plasmidi nelle
cellule degli organismi complessi. L’integrazione in un genoma
può creare dei problemi sia al frammento da integrare sia al
genoma ospite. C’è stata e c’è una notevole differenza tra i modi
di produrre organismi transgenici vegetali o animali.
Per alcuni organismi vegetali si possono usare con facilità dei
trasposoni che facilitano l’integrazione nel genoma.
Per integrarsi un costrutto deve comunque ricombinare. Finchè
non erano note molte sequenze la ricombinazione era esclusa
anche perché evento raro (≈ 10-6)
Oragnismi transgenici II
Per fare ricerca i primi organismi transgenici sono stati la
Drosofila ed il Topo e tra i vegetali Arabidopsis e Nicoziana. In
generale sono stati usati gli organismi modello già usati in
genetica di cui c’erano sufficienti informazioni. Per gli organismi
vegetali il problema principale è la veicolazione del DNA
attraverso le protezioni esterne come la cellulosa, per cui o sono
stati usati virus o batteri trasformanti o micro sfere ti metallli
pesanti (oro) come proiettili adsorbiti col DNA.
Negli animali le cellule sono più facilmente penetrabili e però
l’uso dei virus come veicolo è il metodo più efficiente, però resta
il pericolo del virus che deve essere deattivato e non deve
ricombinare per ridare origine al virus “wild type” infettivo.
Nel topo la tecnica iniziale è stata quella di utilizzare la
blastocisti che era già utilizzata dai biologi dello sviluppo. Il
primo successo è stato ottenuto generando un topo chimerico.
Topi chimerici e transgenici
Per fare un organismo transgenico si deve arrivare a
trasformare le cellule della linea germinale oppure il nucleo
dello zigote. Nel topo in cui è problematico intervenire sugli uni
e sull’altro è stato utilizzata la blastocisti su cui già veniva fatta
sperimentazione. La facilità di uso dipende dal fatto che si
riconosce più facilmente da uno zigote e si riesce a trovare
facilmente nell’utero di una topolina accoppiata durante la
notte. Dopo l’accopiamento in poche ore si forma un tappo
vaginale che è il segno dell’avvenuta fecondazione. La topolina
da accoppiare viene trattata con estrogeni per far avvenire
l’ovulazione e per aver un buon numero di blastocisti.
I primi topi chimerici sono stati ottenuti iniettando direttamente
il DNA nella blastocisti che lo riassorbe e con buona probabilità
riesce a trasformare le cellule.
Dal chimerico al transgenico
Iniettando il DNA nella blastocisti qualche cellula potrà assorbire
il DNA, ma non tutte e quindi si otterrà un topo chimerico in cui
non tutti i tessuti hanno nel genoma il DNA iniettato (con un
costrutto adatto per essere funzionale ed esprimersi, cioè un
gene completo e più spesso artificiale, recante un promotore
forte costitutivo come quello di un virus). Questo tipo di vettore
se porta un gene per una resistenza ad un antibiotico non deve
essere diffuso fuori dal laboratorio.
Tra questi topi chimerici ci potrebbe essere quello che ha
assorbito e ricombinato nella linea germinale e che quindi può
dare origine ad una linea transgenica. Quindi va fatto un incrocio
con un topo della linea isogenica per poter riconoscere
eventualmente dal pelo se si è trasmesso il gene marcatore.
Quindi se si ottiene una F1 transgenica si reincrocerà sempre
con topi isogenici a quelli utilizzati per fare il topo chimerico.
Controllo del topo transgenico
Come si può essere certi che il topo sia transgenico a parte il
colore del pelo (non sempre si associa un marcatore per il
colore del pelo) ? Si deve analizzare il DNA dell’animale, nel
caso del topo si prende un frammento della coda che non
provoca troppo trauma o danno fisico e se ne analizza il DNA
tramite Southern blot o tramite PCR.
Per sapere dove si è integrato si deve clonare il frammento
corrispondente a quello del Southern con PM alterato e
sequenziarlo, con PCR si deve fare PCR inversa e trovare la
sequenza dei frammenti limitrofi al costrutto integrato. Se il
gene che si esprime corrisponde ad un fenotipo atteso, oppure
diverso dal wt si ha questa ulteriore verifica. Per sapere se si
sono integrate più copie con il Southern si ha risoluzione
migliore e cosa si vede? Per PCR inversa cosa si deve fare per
vedere se c’è più di una copia ?
Schema in cui si mostra l’iniezione con cellule, col DNA è uguale
Come si forma la blastocisti
Stadi diversi di maturazione dalla morula
alla blastocisti
Ricombinazione omologa e cellule ES
Topi transgenici con iniezione diretta del DNA nella blastocisti
possono avere il gene esogeno in un punto qualunque del
genoma e non sempre si potrà esprimere come vorremmo,
dipende dal sito in cui si inserisce. Potrebbe essere un sito
silente oppure che provoca danno ad una funzione del topo, per
cui non è vitale. Soprattutto si riesce solo a fare esprimere un
gene e non si può interferire con una funzione genetica
endogena del topo, caso mai si interferisce col metabolismo.
Capecchi ed alcuni altri sono riusciti a coltivare cellule ES
embrionali staminali di topo e a trasformarle per cui si poteva
ottenere un topo chimerico con efficienza iniettando le cellule già
con il DNA integrato e sapendo anche dove ecc.
La cosa più eclatante è stata la possibilità di ottenere cellule ES
trasformate con DNA ricombinato in un sito specifico per
ricombinazione omologa. Prime prove con gene HPGRT
Vettore per Ricombinazione omologa
I primi esperimenti di ricombinazione omologa furono fatti da Capecchi
con il gene per la resistenza HGPRT ipoxantina-guanina fosforibosil
Transferasi.
Il problema e’ di selezionare le cellule con un fenotipo, ma sono pochi
i geni con un fenotipo selettivo, in tale assenza di norma si utilizza la res.
per un antibiotico.
Il costrutto per far avvenire la ricombinazione omologa deve avere una
regione omologa a quella con cui vogliamo ottenere la ricombinazione:
mut.
x
x vettore a struttura W
w.t.
Di solito si utilizza un costrutto che abbia due regioni di omologia
(spalle) rispetto alla regione che si vuole inserire.
La frequenza e’ stata studiata ed e’ ~ 1- 2 x10 -6
Controlli per l’integrazione di vettori
con ricombinazione omologa
Controlli delle cellule staminali ES con cui si devono ottenere
successivamente i topi transgenici.
La trasformazione delle cellule ES si può fare per
elettroporazione o con metodi trasfettanti che permeabilizzano la
menbrana, si aliquotano le cellule e si opera la selezione per
l’antibiotico. Si espandono le colonie per avere cloni isogenici
(tutte le cellule di un clone hanno avuto lo stesso evento di
ricombinazione). Si analizzano i diversi cloni per PCR per vedere
se la ricombinazione è avvenuta come desiderata, cioè tramite le
spalle del vettore nel sito omologo. Il vettore conterrà nella
regione non omologa di solito una resist. E magari un marcatore
di espressione (lac z che può far colorare di azzurro le cellule
ricombinanti con l’indicatore). Si amplifica per PCR partendo dal
vettore con una regione esterna
PCR di controllo di integrazione
resist. antibiot.
genoma org
a
b
a e b sono le sequenze omologhe al gene con cui si
vuole fare avvenire la ricombinazione ed il Knock out
della funzione, per cui per verificare l’integrazione con
PCR un primer dovrà essere nella regione esogena e
l’altro nella regione genomica limitrofa alla sequenza
che è stata inserita nel vettore che è presente in
entrambe e così permette la ricombinazione omologa
Topi transgenici mutanti condizionali
Il limite principale dei topi transgenici knock-out per un gene e’la
possibile mortalita’ degli omozigoti durante lo sviluppo.
- una soluzione per questo problema potrebbe essere l’induzione della
mutazione tempo e tessuto specifica
- e’ stato applicato il sistema di ricombinazione fagica (fago P1) Cre-Lox
utilizzato anche in biologia cellulare perche’ inducibile
- Cre e’ la ricombinasi (causa ricombinazione) e LoxP (locus di crossover
in P1), serve per mantenere una sola copia del genoma, evita i multimeri
- i siti Lox sono costituiti da palindrome di 13 bp ed una regione centrale
di 8bp
- la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamento tra due strutture Lox
allineate originando delezione se sono in tandem, inversione se sono in
palindrome, duplicazione se sono su cromatidi fratelli e integrazione se
c’e’ un elemento in un plasmide ed un altro nella sequenza dove si
integra (vedi fig. 1)
Mutanti condizionali
Il sistema cre-lox
Sfruttando il sistema di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox
e la ricombinasi Cre, si possono ottenere dei mutanti che
perdono la regione voluta solo attivando la ricombinasi Cre.
Si devono costruire dei vettori con siti Lox (di solito in due
introni diversi) all’esterno della regione genetica da eliminare. Si
chiamano floxed gli esoni o le regioni da excidere.
Con questa strategia si possono ottenere topi transgenici per
geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto con
l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far
avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si
esprime o dove si induce Cre.
Il costrutto per il gene floxed
costrutto
esone x
induz. di Cre
ricombinaz.
e delez. neo
esone y
esone x
introne x
loxP - neo - loxP
neo
esone x introne x
loxP
esone z
gene tk
loxP
loxP - neo - loxP
ricombinaz.
omologa
costrutto
ricomb.
introne x
esone z
esone y
gene tk
loxP
esone y
esone z
loxP
gene tk
Il gene per la timidino kinasi del virus Herpes simplex rende le cellule
sensibili al Ganciclovir
Nel caso di ricombinazione non omologa il gene tk non verra’ eliminato e le
cellule potranno essere eliminate con la selezione dell’antibiotico
Dopo l’eliminazione della resistenza alla neomicina per l’induzione del gene
Cre le cellule ES mutanti sono pronte per essere iniettate nelle blasocisti
Topi transgenici che esprimono
Cre
Controllo dell’espressione di Cre tramite
promotore tessuto specifico
Enhancer tessuto specifico del gene di topo mDach I (D6)
il promotore è attivato al giorno 10.5 (post coitum)
Il topo D6Cre incrociato con il topo Gtrosa (B6.129S7) gal si colora in
blu perché libera l’espressione eliminando un gene floxed interposto tra
il promotore e LacZ.
sito per topi con costrutti Cre
http://authors.elsevier.com.
http://www.mshri.on.ca/nagy/Cre-pub.html
Ceppi di topo che esprimono il gene Cre in tessuti diversi
costrutto per un gene del SNC
pJOJO
cDNA Ngi
CMV-IE
 actina
loxP-GFP-loxP
IRES
lacZ - poly A
Ngi Nerve growth inibitor da gene trapping
CMV promotore del citomegalovirus
IE enhancer  actina di pollo
GFP green fluor. protein floxed
IRES internal ribosome entry site di encefalomiocardite
Lac Z per la  galattosidasi
Ligand inducible Cre Recombinase
L’attivita’ di molti enzimi (oncoproteins, fattori di trascriz., RNA-binding prot., kinasi) puo’
essere controllata in maniera dipendente dal Ligando se fusa al dominio
che lega il ligando LBD (ligand binding domain) di un recettore di un ormone
steroideo.
E’ stata fatta una proteina chimerica attiva della ricomb. Cre - LBD del
recettore dell’estrogeno (ER) per cui l’attivita’ della ricombinasi Cre-ER
dipende dalla presenza di 17-estradiol. Per non avere il controllo della
proteina in presenza di estradiolo endogeno:
e’ stato mutato il LBD del recettore ER (Cre-ERT) in maniera da legare
solo un ligando sintetico (tamoxifen =Tam, 4idrossi tamoxifen=OHT) sfruttando la
mutazione nota (Gly 525 Arg). Questo costrutto funziona in cellule in vitro.
-Esperimento di espressione del gene in topo transgenico :
costrutto messo sotto il controllo del promotore/enhancer del gene IE di
CMV (citomegalovirus) il frammento PvuII del costrutto pCMVCre-ERT
iniettato in zigoti F1(C57BL/6XSJL), analisi del transgene da DNA caudale.
Prova di espressione e funzionamento su un topo transgenico
“floxed” per il gene del recettore dell’acido retinoico  RXR
dopo induzione di Cre (controllo di funzionalità di Cre)
7
E8
E9
8
RXR(targetet floxed gene)
5
Tk neo
E8
LoxP
RXR(targetet floxed gene
Excision of floxed marker
After CRE recombinase)
50
40
30
20
Prodotto di PCR 156 bp
Primers 7 e 8
7
E8
E9
8
E9
6 LoxP
Prodotto di PCR 190 bp
Primers 7 e 8
100
80
60
40
10
20
0
0
mRNA CRE Er %
RXR wt
Livello di espressione di CRE (pallini) e di excisione dopo 3 giorni e dopo 1 giorno nella coda
Lavoro Victr 3 e Victr 20 gene trap
Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol 392 / 9Aprile pp 608611: Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse
embrionic stem cells (ES). Brian P. Zambrowicz et al.
Gene trapping : metodo di mutagenesi per inserzione random con
vettori per geni reporter o selezionabili.
-l’inserzione genera la marcatura (tags) di geni successivam. clonabili
-espressione solo se l’inserzione avviene in introni, esoni o promotori di
geni attivi restringendo il tipo di geni marcabili
-finqui’ non esiste automazione per l’identificazione dei geni bersaglio
che possono non essere trascritti o corrispondono alla regione 5’non
tradotta,
Per superare questi limiti sono stati sviluppati due nuovi vettori per
GeneTrapping: VICTR3 e VICTR20
Gene trapping tramite Victr 3 e 20
vettori per il 3’o 5’ “trapping”(presenza di LTR virali per
l’integrazione nel genoma ospite)
LTR
VICTR3
VICTR20
LTR
PGK
SA IRES geo
puro
pA
SD
PGK
LTR
puro
SD LTR
Wild-type locus
SA IRES geo pA
AAAAAn
PGK
G
LTR
puro SD LTR
AAAAAn
G
Costrutti
VICTR3 VICTR20
2 componenti : - a) acquisizione di sequenza con promotore della PGK
(fofsfo glicerokinase) di topo attiva nelle cellule ES fuso alla Puromicina Nacetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice donor)
- b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter
(colorimetrico) con sito polyA (SAgeobpA o SAIRESgeobpA)
Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere
marcati (trapped) e la sequenza si individua tramite RACE 3’ del cDNA di
fusione e ricerca in banca dati del gene.
-Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD ricercando il gene della
Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferase per
ricombinazione omologa nell’ introne II. (I geni Hprt e tk timidino-kinasi
mutati danno la sensibilita’ al terreno HAT hypoxanthine, aminopterin
and thymidine e solo Hprt resistenza alla 6-thioguanina). La sequenza
della 3’RACE di colonie Purom. res. hanno confermato l’integrazione
nel sito corretto confermando la capacita’ mutagenica del costrutto.
Race per gene trapping
gene trapping di VICTR-3/VICTR-20
VICTR-3 è costruito per funzionare con l’integrazione all’interno
geni attivi e non attivi.
Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare
RACE 3’ ed eventualmente gene walking al 5’ dopo aver
individuato la regione.
costrutti per gene trapping
PT1  geo lacz neo
ei
 geo
ee
pA
ei engrailed 2 intron; ee eng 2 exon
geo = lac z - neo fusion
pA poly adenilation signal
U3  geo
U3 LTR region enhancerless Mol mur Leuk
Sup 5 E. coli sup F tRNA
 geo
U3
 geo
RU5
Sup 5
U3
RU5 Mason-Pfizer monkey virus translational enhancer
TS4
sa
Lac Z
P-neo
RU5