Lezione V-VI
11 Novembre 2009
corso di genomica
a.a. 2010/11
aula 6 martedì ore 14.00-16.00
giovedì ore 13.00-15.00
corso di laurea specialistica
magistrale Biotecnologia
questa genomica
da dove si è detto di partire?
tutto il mondo è paese, la terra è tonda e anche la biologia
considerando la circolarità ogni punto va bene
consuntivo, riepilogo, banalizzazione: i genomi si possono
usare a nostro comodo tanto derivano uno dall’altro
la scelta dei vari organismi dipende dall’uso che se ne vuol
fare
per avere mutanti
• si prendono i polimorfismi disponibili
• o si inducono mutazioni
• o si costruiscono organismi transgenici
• o si creano costrutti da studiare in cellule coltivate in vitro
• o si lavora in vitro su supporti artificiali
sempre per osservare differenze “fenotipiche” ossia
differenze di funzionamento
il genoma non trascritto e
tradotto
qualcuno ha inventato anche la parola metaboloma
una per tutte, queste parole del paroloma vorrebbero
indicare lo studio di quell’argomento in maniera globale
vada per genomica che deriva da genoma, parola già
usata
vogliamo capire come un genoma intero si comporta e
quali strutture usa durante il ciclo vitale dell’organismo
cioè durante tutti i cambiamenti ambientali a cui è
sottoposto
ripetizione del dramma del genoma
dramma in quanto subisce sollecitazioni drammatiche:
è fatto per funzionare; non può mai stare calmo, fermo e
tranquillo
ritorniamo allo zigote, 1) si fondono i due genomi dei
gameti che per maturare da diploidi sono diventati aploidi
icromosomi si condensano e decondansano, gli istoni
subiscono n+1 trasformazioni, scivolano e si staccano, il
Dna si metila e demetila, si svolge o superavvolge,
tutto questo interagendo con proteina nucleihe, matrice e
se stesso, compartimentazione, riarrangiamenti somatici
la dinamicità
il genoma è vecchio ma gagliardo
come vi ho detto è previsto tutto anche che si rompa, che
ricombini,
restando alle funzioni enzimatiche si possono ancora
individuare e mappare nel genoma individuando nei genomi
più complessi i geni ortologhi ed eventualmente parologhi
individuati negli organismi modello più semplici
il lievito ha fatto capire il funzionamento di molti onco-geni e
geni dell’apoptosi, della trasduzione del segnale e ciclo
cellulare e tanti altri
invece le regioni non codificanti come si
trovano?
questo è il gioco più interessante!
potete sbizzarrire tutta la vostra fantasia
quante funzioni vi vengono in mente?
provate ad elencarle!
proviamo a scavare!
secondo me sono tante.
fenotipo / mutanti /polimorfismi
quante variabili sono presenti
quanti approcci si possono utilizzare:
si può iniziare dai vari punti, in silicio, in vitro, in vivo
analisi dei fenotipi (organismi polimorfici dall’ambiente)
produzione e analisi dei mutanti (per supplire ai fenotipi
degli organismi di laboratorio)
sempre un fenotipo si analizza
analizzare le interazioni
se un sistema è dinamico non se ne può prescindere
vogliamo vedere come è fatto, come cambia ed interagisce
analisi causa - effetto
dall’analisi descrittiva dei fenomeni all’interpretazione
dei meccanismi
il metodo di analisi cambia
si inventano gli approcci diversi utilizzando le tecniche
diverse sempre per approcci di tipo globale
in silicio dalle banche dati
in vitro con metodi di screening
in vivo con campionamenti
comunque i metodi partono dai confronti
esempio topo / uomo
due genomi conosciuti
mutanti umani spontanei polimorfismi già esistenti
mutanti di topo indotti
studi per differenza di fenotipi (espressione ed analisi ai
diversi livelli con metodi di indagine diversa)
modello umano
mutanti a disposizione: genetica di popolazione
analisi di linkage
approccio globale: analisi genomica globale
“wide genome screening” in che consiste come è possibile”
applicazione di tecniche diverse per lo screening
punto di partenza: conoscenza dei polimorfismi
polimorfismi = mutazioni fissate
dalle tecniche iniziali a queste genomiche
mappaggio dei polimorfismi
analisi dei polimorfismi con stessi strumenti e tecniche
polimorfismi più comuni: SNPs e VNTR
come si possono pescare nel genoma:
- PCR e digestione del sito polimorfico
- primer extension (solo su sequenza + e non -)
- appaiamento dell’oligo e PCR
- PCR e ibridazione su chips
- PCR e resequencing
PCR e digestione del sito polimorfico
HpaI GTT’AAC
n
600 bp
3’
5’
5’
3’
3’
5’
HpaI * +/-
5’
3’
200 bp
400 bp
rilevazione per elettroforesi
SM
sample 1
sample 2
sample 3
HpaI +
HpaI +/-
600 bp
400 bp
200 bp
SM= size marker
HpaI -
omozigoti
eterozigote
primer extension - appaiamento dell’oligo e
PCR
effetto simile con tecniche diverse
estensione / non estensione (polimerasi normale, Klenow)
amplificazione / non amplificazione (PCR)
PCR su piastra o ibridazione su chips
metodo globale con maggior output
dipende dal numero di PCR possibili su piastra e multiplex
analisi di singoli genomi per molti siti polimorfici:
analisi di amplificazione su piastra per fluorescenza
tipo real time
analisi per ibridazione su chips con le sequenze genomiche
polimorfiche preamplificate
PCR e resequencing
amplificazione dei frammenti da sequenziare per i siti
polimorfici
sequenziamento con metodo classico Sanger
sequenziamento con ibridazione su microchips con
oligos polimorfici (fluorescenza)
sequenziamento shot-gun degli interi prodotti tramite
chips ed oligos-adapters legati a palline (micro-beads)
aggiunte successive di nucleotidi fluorescenti
produzione di mutanti
processo analogo
produzione di mutanti per ottenere fenotipi nuovi
dacellule in coltura o da cellule staminali per ottenere topi
transgenici
metodo di mutagenesi
esempio: ENU ethyl-nitroso urea
ottenuti i topi inizia lo screening dei fenotipi di interesse
analisi di genomica funzionale “delle interazioni”
quale punto di arrivo
in questi approcci si risale dai fenotipi ai genotipi
ricerca dei genotipi corrispondenti tramite dei marcatori
o con confronti dei marcatori
i confronti con i polimorfismi
mutanti e fenotipi
dal lievito all’uomo
sapendo che funzione andare a cercare o che metodo
analitico si adotta si può immaginare il modello
sperimentale
esempio semplice: vedere i siti di metilazione che
variano alle varie condizioni
dalle regioni con maggior attività si inferisce se esistono
clusters e conoscendo il genoma a cosa corrispondono
un esempio di un approccio globale su lievito
un esempio di lievito
Replication and active demethylation represent partially overlapping mechanisms for erasure of
H3K4me3 in budding yeast.
Radman-Livaja M, Liu CL, Friedman N, Schreiber SL, Rando OJ. PLoS Genet. 2010 Feb 5;6(2)
Abstract (il PDF è sul sito web con tutte le figure)
Histone modifications affect DNA-templated processes ranging from transcription
to genomic replication. In this study, we examine the cell cycle dynamics of the
trimethylated form of histone H3 lysine 4 (H3K4me3), a mark of active chromatin
that is viewed as "long-lived" and that is involved in memory during cell state
inheritance in metazoans. We synchronized yeast using two different protocols,
then followed H3K4me3 patterns as yeast passed through subsequent cell cycles.
While most H3K4me3 patterns were conserved from one generation to the next,
we found that methylation patterns induced by alpha factor or high temperature
were erased within one cell cycle, during S phase. Early-replicating regions were
erased before late-replicating regions, implicating replication in H3K4me3 loss.
However, nearly complete H3K4me3 erasure occurred at the majority of loci even
when replication was prevented, suggesting that most erasure results from an
active process. Indeed, deletion of the demethylase Jhd2 slowed erasure at most
loci. Together, these results indicate overlapping roles for passive dilution and
active enzymatic demethylation in erasing ancestral histone methylation states in
yeast.
yeast genomic methylation screening
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
fig 2 yeast methylation
clusterizzazione
dell’effetto
QuickTime™ e un
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Clustering of CCTS and
CCA H3K4me3 patterns.
Microarray measurements
of H3K4me3 for each
nucleosome was centered
to zero for each time course
to emphasize relative
variation in methylation
levels, and concatenated
data for both time courses
was subject to k-means
clustering with k = 6.
fig 3 yeast histone methyl
Nucleosomes methylated
during cell cycle arrest lose
H3K4me3 during the first S
phase after release.
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fig 6 yeast histone methylation
Replication is not required
for loss of H3K4 methylation
QuickTime™ e un
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fenotipi mutanti e polimorfismi*
guardando la variabilità
strutture variabili
dalla variabilità e da come variano* si può inferire l’importanza della struttura e
dopo in cosa consiste la struttura e forse la funzione
strutture invariabili
dove si guarda (reg coding e non coding)
cercando le funzioni genomiche
creazione di esche per trovare con cosa interagiscono
riprova in vivo con l’organismo transgenico per una
conferma
fare i confronti
il caso precedente è un esmpio interessante di approccio
globale:
si fanno i confronti multipli di tutti i siti o markers montati
sul chip di cui si fa lo screening per la metilazione
dell’istone (con immunoprecipitazione) e l’occupazione
dei nucleosomi (per amplificazione)
l’ibridazione dei microarrays avviene con sonde ad RNA
si confrontano le regioni che ibridano o no a seconda se
sono occupate o meno oppure che si amplificano o meno
approccio diverso
strutture miste: interazioni DNA-proteine
da uno screening con two hybrid systems ricerca del
fenomeno da riprodurre in vitro
verificare se lo stesso costrutto interagisce con le stesse
proteine
tentativi non sempre di successo con two hybrid systems
le tecniche hanno delle approssimazioni
esca e oggetto interagente
dall’approcio riduzionistico all’approccio olistico
(non sempre si riesce ad avere un approccio globale con
una tecnica nata per essere riduzionistica)
il doppio ibrido
è un esempio possibile (con molti falsi positivi) come
spesso negli screening
ricerca con un’esca dei fattori che la legano (di solito fattori
di trascrizione) a volte anche repressori (sistema tet)
il gene reporter sarà attivato o represso
• si usa il genoma su chips e si trova in quanti punti lega
una prot.
• si usa un estratto nucleare e si trovano quali complessi
vanno a legare un sito, con mass spettr. o
immunoprecipitaz. si isolano le prot. del complesso
voglio trovare tutti i siti di legame di un
fattore di trascrizione
lo screening è possibile se con uno o più chips di
microarray riesco a rappresentare tutte le regioni con
tutte le variazioni (anche polimorfismi SNPs) dopo una
analisi genomica “in silicio” per quel fattore di
trascrizione. Cioè identificazioni di tutti i punti possibili
del genoma con software predittivo per un fattore (si
usano banche dati di tutti i siti (seq. di consensus)
descritti e trovati per quel fattore
dal vitro al vivo
il sistema biologico dinamico e interattivo
i metodi globali: con la genomica o post-genomica posso
simulare “in silicio” (metodo elettronico) e fare uno
screening da cui quello in umido sul banco sperimentale
cercare chi interagisce
screening
in vitro
interattori
in vivo
fenotipi e mutanti