Polimorfismi,
mutazioni e metodi
per evidenziarli
DNA satellite
Unità da 5 a 200 bp.
Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi
Polimorfismi del DNA: microsatelliti
Minisatelliti
Unità fino a 5 bp. Segmenti lunghi fino a 25 kb
Allele A TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG
Allele B TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG
Microsatelliti
Unità < 4bp. Segmenti lunghi fino150 bp
Allele A TACCAAGGTACACACACGGTACCATGG
Allele B
TACCAAGGTACACACACACGGTACCATGG
Allele C
TACCAAGGTACACACACACACGGTACCATGG
Allele D
TACCAAGGTACACACACACACACGGTACCATGG
Perché i microsatelliti sono così polimorfici?
Polimorfismi del DNA: SNP (single nucleotide polymorfism)
---ATGTTGAAGTTCAAGAATTCTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGTATTCTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGCATTCTGTGCGGAAC-----ATGTTGAAGTTCAAGGATTCTGTGCGGAAC---
Come evidenziare i polimorfismi?
RFLP= restriction fragment length polymorphism
Gli RFLP possono evidenziare sia polimorfismi dovuti a mutazione
di singoli nucleotidi (che fanno comparire o scomarire siti di
restrizione) sia polimorfismi di tipo minisatellite (VNTR = Variable
Number of Tandem Repeats)
I polimorfismi di tipo microsatellite possono essere evidenziati
mediante PCR (STR = Short Tandem Repeat)
Due vantaggi principali rispetto agli RFLP: più facili da evidenziare (PCR),
e molto più polimorfici (elevato tasso di eterozigosità)
I marcatori polimorfici (soprattutto gli STR)
sono stati estremamente utili per ottenere una
prima mappa globale del genoma umano
La mappa genetica ottenuta con i marcatori è fondamentale per
mappare i geni responsabili di patologie umane (positional cloning)
La posizione di un gene malattia viene definita valutando la frequenza di
ricombinazione del carattere fenotipico rispetto ai marcatori polimorfici
disponibili (rivedere il concetto di linkage dalla genetica)
I marcatori polimorfici sono molto usati nelle indagini di medicina
legale (identificazionie di indivudui, attribuzione di
paternità/maternità). In passato si usavano gli RFLP, oggi
soprattutto gli STR (Test del DNA standard messo a punto
dall’FBI= analisi di 13 marcatori STR altamente polimorfici).
L’uso della PCR consente di fare diagnosi su tracce.
Quando il materiale biologico è troppo scarso o
di qualità scadente, può essere utile analizzare i
polimorfismi del DNA mitocondriale
(moltissime copie per cellula)
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli
(o pochi) nucleotidi
Amplificazione della regione mediante PCR con oligonucleotidi fiancheggianti il
punto di interesse e successiva digestione con enzimi di restrizione
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli
(o pochi) nucleotidi
L’utilizzo combinato della PCR e dell’analisi di restrizione permette di
diagnosticare specifiche mutazioni molto più facilmente che con il Southern Blot
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli
(o pochi) nucleotidi
Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi
allele-specifici
P1
bA
P1
P2
bS
P2
PCR
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli
(o pochi) nucleotidi
Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi
allele-specifici
Metodi per evidenziare
polimorfismi di singoli
(o pochi) nucleotidi
Amplificazione allele-specifica
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli
(o pochi) nucleotidi
Amplificazione (di DNA genomico o cDNA) e sequenziamento diretto.
L’utilizzo simultaneo della PCR e di traccianti
fluorescenti consente l’analisi simultanea (multiplex) di
moltissimi polimoprfismi
Diagnosi genetica pre-impianto
Diagnosi genetica pre-impianto
Diagnosi genetica pre-impianto
Possibile già oggi per malattie monogeniche per cui
sia nota la mutazione
In futuro, almeno in teoria, è probabile che questa
tecnica, in combinazione con l’analisi simultanea di
moltissimi polimorfismi, possa permettere una
valutazione di tratti genetici complessi.
Quali i vantaggi, e quali i pericoli?