Terapia Genica
Terapia cellulare
• Allotrapianto: cellule provenienti da un
donatore della stessa specie
• Autotrapianto: cellule provenienti dallo
stesso paziente
• Xenotrapianto: cellule provenienti da
animali di specie diverse
Strategie terapeutiche
genetico-molecolari
• Produzione di proteine normali in diversi
sistemi di espressione (batteri, lieviti,
cellule in coltura, animali geneticamente
modificati).
• Produzione di anticorpi geneticamente
modificati.
• Produzione di vaccini geneticamente
modificati.
• Terapia genica.
Terapia genica
Insieme di procedimenti atti a a curare o
ad alleviare una malattia modificando
geneticamente le cellule dei pazienti.
Può essere in vivo o ex vivo
Vantaggi teorici della terapia genica
• Correzione radicale dei difetti
• Possibilità di agire su meccanismi
molecolari per i quali risulta
estremamente difficile sviluppare
farmaci specifici
• Vantaggi economici (se è
permanente eviterebbe la necessità di
trattamenti ripetuti)
Possibili limitazioni della
terapia genica
• Mancanza di necessità per
disponibilità di terapie alternative
• Mancanza di efficacia
• Grandi problemi tecnici
• Costi
• Effetti indesiderati (espressione non
regolata, mutagenesi inserzionale,
passaggio delle modifiche alla linea
germinale)
Attuali problemi tecnici della
terapia genica
• Efficienza di trasferimento (vettori
virali migliori di non virali)
• Selettività del sistema di
trasferimento
• Espressione instabile nel tempo
• Espressione non regolata
• Reazioni del sistema immunitario
• Problemi etici
Quando si può pensare di curare una
malattia con la terapia genica?
• Malattia pericolosa per la vita, ma dagli
effetti potenzialmente reversibili.
• Gene clonato.
• Disponibile sistema di trasferimento
genico efficiente per le cellule affette,
che garantisca espressione stabile nel
tempo.
• Non richiesta regolazione precisa del
gene in questione.
Strategie terapeutiche
Incremento della dose genica
Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di
funzione totale o parziale di un gene (ad esempio
patologie autosomiche recessive o autosomiche
dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)
Strategie terapeutiche
Correzione mirata della mutazione genica
Necessaria per le patologie causate dalla
presenza di un prodotto genico alterato, che
agisce attraverso un meccanismo dominante o
dominante-negativo. Efficace anche nel caso di
una perdita di funzione.
Strategie terapeutiche
Inibizione mirata dell’espressione genica
Strategia utile per le patologie causate dalla
presenza di mutazioni ad effetto dominante o
dominante negativo.
Strategie terapeutiche
Inibizione mirata dell’espressione genica
RNAi
Inibizione mirata dell’espressione genica
RNA-interference
RNAi
Inibizione mirata dell’espressione
genica
Ribozimi
RNAi
Strategie terapeutiche
Uccisione diretta di cellule patologiche
Strategie terapeutiche
Uccisione di cellule patologiche mediata
dal sistema immunitario
Come faccio entrare il DNA nelle
cellule, e cosa gli succede quando è
entrato?
Vettori non virali
Integrazione
casuale
Integrazione
sito-secifica
Vettori virali
Vantaggi dei vettori virali
• Alta efficienza di trasduzione
Svantaggi dei vettori virali
• Possibilità di generare nuovi virus patogeni
per ricombinazione con eventuali virus
presenti nell’ospite
• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si
integrano in maniera casuale nel genoma)
• Molecole di DNA di dimensioni limitate
• Reazioni immunitarie
• Costi elevati
Vantaggi dei vettori non virali
• Impossibile la generazione di nuovi virus
patogeni
• Riduzione del rischio di reazione immunitaria
• Possono trasferire molti tipi diversi di
molecole, e permettono di trasdurre molecole
di DNA anche molto grandi
• Bassi costi di produzione
• Possibilità di produzione in grandi quantità
Svantaggi dei vettori non virali
• Scarsa efficienza
• Se si usano molecole di DNA a doppio
filamento anche questi vettori ossono dare
mutagenesi inserzionale
Vettori non virali
Liposomi
Vettori non virali
Endocitosi mediata da recettore
Vettori non virali
Elettroporazione e altri metodi fisici (shotgun)
Cosa si può far entrare nelle
cellule con vettori non virali
•
•
•
•
Plasmidi
Molecole di DNA a doppio filamento lineari
Oligonucleotidi DNA
Oligonucleotidi RNA (varie modificazioni
chimiche, come i gruppi morfolino)
• Ribozimi
• Polipeptidi
Vettori virali
In tutti i casi si tratta di virus difettivi, che
possono essere prodotti solo grazie a particolari
linee cellulari capaci di complementare i difetti
del virus. In ogni caso la loro preparazione deve
seguire queste fasi obbligate:
1.Costruzione del genoma ricombinante
2.Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di
produrre le particelle virali
3.Raccolta e analisi del virus
4.Trattamento del paziente
Vettori virali:
caratteristiche principali
•Retrovirus : possono infettare solo di cellule in
divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale.
•Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono
infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in
maniera casuale.
•Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano
stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie.
•Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito
specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile
produrli ad alto titolo.
•Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni,
ma importanti effetti citotossici.
Retrovirus
•Enveloped virus
•RNA genome (2 copies)
•dsDNA enters into the nucleus and integrates
upon mitosis
•Enters the cell by fusion
•LTR: viral transcription, polyad., replication,
integration
Vettori retrovirali
amphotropic
Gag
Pol
Env
Gag
Pol
Env
LTR
LTR
encapsidation cell line
Psi -
Psi -
ecotropic-MoMulv
LTR
ADA
Psi +
plasmid transfection
Vettori retrovirali: evitare la ricombinazione
encapsidation cell line
Virus difettivo integrato
LTR Gag
Pol
Env Psi -
LTR
LTR Gag
LTR
Pol
Gene
Plasmide
Gene
Env Psi -
Particelle virali
ricombinanti
Psi +
Psi +
LTR
Gag
Pol
Env
Psi +
RT+integrasi
Capside
LTR
Gag
Pol
Virus wild type in cellule normali
Env
Psi +
Involucro
LTR
Gag
Pol
Env
Psi +
Virus
Virus wild type in cellule normali
LTR
Gag
Pol
Env
Psi -
RT+integrasi
LTR
Gag
Pol
Env
Psi -
In assenza di un genoma con sequenza Psi+, no particelle virali
Linea di packaging con unico provirus difettivo integrato
LTR
Gag
Pol
Env
Psi -
RT+integrasi
LTR
Gag
Pol
Env
LTR
Psi -
ADA
Psi +
Vettore virale
Ori
Amp
Linea di packaging con unico provirus difettivo integrato
LTR
Gag
Pol
Env
LTR
Psi -
ADA
Psi +
Ori
Amp
LTR
Gag
Pol
Env
Psi LTR
ADA
Linea di packaging con unico provirus difettivo integrato
Psi+
LTR
Gag
Pol
Env
LTR
Psi -
ADA
Psi +
Ori
Amp
LTR
Gag
Pol
Env
Psi -
Linea di packaging con unico provirus difettivo integrato
LTR
LTR
Gag
LTR
Gag
Pol
Env
Gag
Pol
Pol
Env
Psi -
Psi -
Env
LTR
Psi Gag
Pol
Env
Psi -
Linea di packaging con due provirus difettivi integrati
LTR
Gag
Pol
Env
Psi LTR
LTR
Gag
Pol
Env
ADA
Psi +
Psi Ori
Amp
LTR
LTR
Gag
Pol
Env
LTR
ADA
Psi Gag
Pol
Env
Psi -
Linea di packaging con due provirus difettivi integrati
Psi+
LTR
Gag
Pol
Env
Psi LTR
LTR
Gag
Pol
Env
ADA
Psi +
Psi Ori
Amp
LTR
LTR
Gag
Gag
Pol
Pol
Env
Env
Psi -
Psi -
Linea di packaging con due provirus difettivi integrati
Trial clinico per deficit ADA
Retrovirus
Trial on 2 ADA patients. Started 1990. 2 years
treatment.
Results published in 1995 Science, Blaese et al
Retrovirus
Ex-vivo Retrovirus-med. gene therapy:
SCIDXI trial 1998, A. Fisher France
• Recessive disease
• X linked
• Defect in the gc gene, receptor for cytokines =>
block in T and NK differentiation
• Ex-vivo gene therapy on CD34+cells: MuLV- gc
20x106 cells/Kg
Retrovirus
A. PCR:
detection of gc DNA
B: RT PCR
Detection of gc RNA
Lymphocyte subsets
protein expression
Retrovirus
• Genoma di RNA singolo filamento.
• Possono infettare solo cellule proliferanti
• Integrazione casuale nel genoma.
• Difficle produrli in grandi quantità (titolo
elevato).
• Successo della terapia dipendente dalla
trasduzione delle stem cells.
• Poco immunogeni.
• L’espressione può andare incontro ad
attenuazione nonostante la persistenza del
virus nel genoma.
• In assoluto sono vettori più utilizzati per
la terapia genica.
Come infettare le cellule post-mitotiche?
Lentivirus
(HIV-1)
Nuclear transport
dependent
• Int (MA, Vpr)
• cPPT-DNA flap
?
Oncoretrovirus
X
Mitosisdependent
Lentivirus (HIV)
• Genoma complesso:
– geni strutturali gag pol env
– geni regolatori tat rev
– geni accessori nef vpr vpu vif
• Tropismo per linfociti e macrofagi
• Infezione persistente / malattia
cronica progressiva
Lentivirus
• Particelle virali ibride difettive per la
replicazionecostituite da:
– Un set minimo di proteine del core derivate
da HIV-1
– Il pericapside di un virus non correlato
(VSV or MLV)
– Un genoma contenente:
• una cassetta di espressione per il transgene
• affiancata da sequenze cis-regolatorie di HIV-1
• non sono presenti geni virali
Lentivirus: costruzione
Costrutto di
trasferimento
RSV
GA RRE
TRANSGENE
GAcPPT
RRE PROMOTORE
PROMOTER GFP

SD
SA
sequenze attive in cis
LTR
Provirus
HIV-1
LTR
U

GAG
VIF
PRO
POL
RRE
ENV
R
TAT
NEF
NEF
REV
SD
sequenze attive in trans
Costrutto
d’incapsidazione
CMV

SD
GAG
RRE
PRO
POL
TAT
REV
polyA
Vettore lentivirale di ultima generazione
CMV
CMV
GAG
RRE
PRO
polyA
POL
Costrutti d’incapsidazione
SD SA
CMV
CMV
VSV-G
SD
RSV
GA RRE
GAcPPT RRE
hPGK
PROMOTER
GFPeGFP

SD
RSV REV polyA
SA
SA
Wpre
polyA
Costrutto
codificante il
pericapside
Costrutto di
trasferimento SIN
(Self-inactivating)
Produzione del vettore
VSV-G polyA
CMV
SD
CMV
GAG

RRE
PRO
polyA
POL
SA
Envelope
RSV
TAT
REV
SD SA
SD
Wpre
SA
Costrutto di trasferimento
Costrutto di incapsidazione
Trasfezione
transiente
Cellule 293T
Cellule HeLa
GA RRE cPPT hPGK
eGFP
GA
RRE
PROMOTER

Titolazione per
diluizioni
seriali
Raccolta a 24
e 48 ore
Concentrazione per
ultracentrifugazione
Lentivirus
GFP expression 3 months after injection
Lentivirus
Control
ALB
promoter
CMV
promoter
Lentivirus
• Genoma ad RNA.
• A differenza degli altri retrovirus possono
infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.
• Integrazione casuale (mutagenesi
inserzionale)
• Scarsissime reazioni immunologiche.
• Elevata efficienza di trasduzione.
• Ottime prospettive per la terapia genica in
vivo.
Adenovirus
Adenovirus
Adenovirus
MLP
E1
ITR
Late genes (L1-L5)
E3
VA
10
20
30
40
50
60
70
IVa2
(E2F.RE)2
E2
E1 mediated regulation
E4 mediated regulation
E2 mediated regulation
80
ITR
90
100
E4
3.6 kb
Vettori adenovirali
E1
MLP
Transgene
10
ITR
Late genes (L1-L5)
E3
VA
20
30
40
50
60
70
80
ITR
90
100
E4
E2
E1
293 cells
ITR
3.6 kb
Vettori adenovirali
Sviluppo di nuove generazioni
di vettori allo scopo di riudrre
immunogenicità e aumentare
le dimensioni degli inserti.
Adenovirus
• Genoma di DNA doppio filamento.
• Possono infettare cellule proliferanti e
post-mitotiche.
• Non si integrano, ma vengono mantenuti
in forma episomica. Pertanto non
determinano mutagenesi inserzionale, ma
sono necessari trattamenti ripetuti.
• Relativamente facile produrli in grandi
quantità (titolo elevato).
• Forti reazioni immunologiche.
Ciclo vitale degli AAV
Fase latente
Fase litica
Ad
Ad
Integrazione
sito-specifica
Replicazione
AAV
ITR
ITR
Rep
Integration
Packaging
Rescue
DNA replication
Integration
Rescue
Cap
Capsid proteins
VP1, VP2, VP3
AAV, preparazione
AAV, infezione di neuroni
Vettori adeno-associati (AAV)
• Genoma di DNA singolo filamento.
• Virus difettivo che richiede per la produzione
la contemporanea presenza di un adenovirus.
• Possono infettare cellule proliferanti e postmitotiche.
• Facile produrli in grandi quantità
• Integrazione sito specifica in un unico locus
innocuo (Cr.19), quindi assenza di
mutagenesi inserzionale.
• Espressione stabile nel tempo.
• Inserti di dimensioni limitate.
• Efficienza di trasduzione variabile.
• Poco efficace se purificato bene.
Herpes Simplex Virus (HSV)
(ds DNA 152Kb, >70 genes)
genome
Latency
transcripts
Latency
promoter
Herpes Simplex Virus (HSV)
• Genoma di DNA doppio filamento molto
grande (152 kb) e complesso (>70 geni).
• Spiccato neurotropismo.
• Nelle cellule infettate è in forma episomica
in uno stato latente.
• Possibile inserire geni molto grandi.
• Forti reazioni immunologiche.
• Presenza di anticorpi contro il virus in
un’elevata percentuale di casi.
Potenzialità di combinazione tra terapia
genica e purificazione cellule staminali
Perché qualcuno sta pensando
seriamente alla clonazione umana?
• Il problema principale della terapia
cellulare è l’istocompatibilità>rigetto
• La clonazione permetterebbe di ottenere
cellule staminali totipotenti dotate delle
stesse caratteristiche antigeniche del
paziente, da usare per il trapianto dopo la
correzione del difetto.
Perché qualcuno sta pensando
seriamente alla clonazione umana?
Cellula somatica
normale
Cellule
somatiche paziente
Cellule totipotenti sane
istocompatibili
Ovocita
Terapia genica del cancro:
potenziamento della risposta immune
Terapia genica del cancro:
sensibilizzazione cellule tumorali a farmaci
TK
Vectors for gene therapy
according to www.wiley.co.uk/genetherapy (june 1999)
Adeno
Lipo
Retro
retrovirus
liposome
adenovirus
retro prd cl
vaccinia
naked DNA
others