Difetti congeniti del metabolismo II
Lezione 2
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Albinismo oculocutaneo OCA
Esistono diverse forme di albinismo: sono
tutte recessive e una forma e’ X-linked
e’ presente eterogeneita’ genetica
L’albinismo oculocutaneo OCA e’ caratterizzato da:
assenza di pigmentazione dovuta all’incapacita’ di
sintetizzare la melanina, mentre il numero dei melanociti
e’ normale. La melanina e’ presente nei capelli, nella cute
e nella retina.
La via che porta alla sintesi della melanina parte dall’amminoacido
tirosina, che e’ coinvolto in una serie di altre reazioni il cui mancato
svolgimento porta alla manifestazione di altri difetti congeniti del
metabolismo: Alcaptonuria e Fenilchetonuria
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La tirosinasi
Le prime due tappe che portano alla sintesi della melanina sono
catalizzate dalla tirosinasi che in una prima reazione idrossila la
tirosina e successivamente catalizza l’ossidazione della
diidrossifenilalanina ottenuta, in DOPA-chinone.
Il gene della tirosinasi e’ stato clonato e sono state
identificate le mutazioni che sono la causa della comparsa
dell’albinismo
Le strategie di clonaggio sono varie: lo scopo e’ quello di identificare la
sequenza di DNA voluta in mezzo a tutte quelle che si possono isolare
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La tirosinasi clonaggio
Dal momento che si conoscevano le basi biochimiche della
patologia e’ stato possibile utilizzare il clonaggio funzionale
Non si conosceva la sequenza della tirosinasi, ma si sapeva che era
coinvolta, pertanto si sintetizzo’ il cDNA a partire da RNA totale
estratto da cellule che sintetizzano l’enzima e si inserirono i cDNA
in fagi.
 Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione
 Produzione di anticorpi specifici per la tirosina
 Screening della library di espressione e isolamento della colonia
 Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato
 Sequenza dei cDNA cercando una ORF
 Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa
 Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni
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Polimorfismo RFLP
 Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite,
microsatellite. Individuabili con southern blottling o PCR
 RFLP: La sonda riconosce il polimorfismo con un particolare enzima,
ma non con altri
A1
B1
B2
A1
B1
B2
endonucleasi A
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Enzima Enzima
A
B
A2
A3
A3
mutazione
elimina il sito
di restrizione
endonucleasi B
Pattern di ibridazione su
filtro
Polimorfismo
 Variazione presente nella popolazione con una frequenza
superiore a 1%
 Polimorfismi proteici
 Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite,
microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR
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Lunghezza
dei frammenti
Alleli identificati dall’ibridazione
su Southern
I1 I2 II1
II2 I3 I4
III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8
Possibile interpretazione dei
risultati
Polimorfismo
RFLP esempio
I
1
2
3
4
II
1
2
III
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1
2
3
4
5
6
7
8
Polimorfismo PCR
Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR
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Analisi delle mutazioni di OCA
I
Il gene della tirosinasi e’ lungo circa 50Kb ed e’
composto da 5 esoni
La ricerca delle mutazioni e’ essenziale per definire se il gene
clonato e’ quello che una volta mutato provoca la patologia in esame
Bisogna tenere presente che le variazioni di sequenza non sempre
sono patogene, possono anche rappresentare polimorfismi che nel
caso delle recessive costituiscono un problema.
Perche?
 Nella popolazione generale e’ impossibile definire se un soggetto
e’ portatore o meno dell’allele patogeno.Bisogna sempre esaminare
gli affetti e i loro genitori, anche i fratelli possono essere fonte di
errore: potrebbero essere non portatori
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Analisi delle mutazioni di OCA
II
 Nell’albinismo oculocutaneo grazie al
sequenziamento del gene e’ stata evidenziata la presenza
di mutazioni diverse in siti diversi del gene (allelia
multipla), che possono provocare fenotipi leggermente
diversi.
 Non confondere questo con l’eterogeneita’ genetica che
e’ pure presente nell’albinismo. Esistono altre forme di
albinismo non legate a mutazione del gene della tirosinasi,
che dipendono da mutazioni di altri loci
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Analisi delle mutazioni di OCA
III
Apriamo una parentesi
 Eterogeneita’ genetica :e’ fra locus
Il fenotipo e’ il risultato di una catena di
interazioni:il risultato finale puo’ risultare simile
anche quando i locus sono diversi.
E’ importante identificare con precisione i criteri
di definizione nel caso dell’albinismo un primo
criterio e’ il dosaggio della tirosinasi
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Analisi delle mutazioni di OCA
IV
Le strategie per individuare le mutazioni negli
affetti o nei potenziali eterozigoti sono varie, la piu’
usata e’ la PCR o l’utilizzo di oligonucleotidi allele specifici
sintetizati ad hoc per le singole famiglie
Come si studiano le famiglie?
Bisogna sempre analizzare i risultati nel loro insieme,
utilizzando le informazioni che vengono dalla popolazione
generale.
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Analisi delle mutazioni di
OCA V
Presenza di piu’ di una mutazione nel DNA dell’affetto:
Le mutazioni possono essere :
Missenso: sostituzione di una base che porta al
cambiamento dell’amminoacido.
La stessa sostituzione e’ presente nella popolazione generale anche
in omozigosi senza conseguenze? se si e’ un polimorfismo e ci dice
che quella regione della proteina o quell’amminoacido non e’ critico
per la funzione.E’ una mutazione conservativa.(L’accumularsi di dati su piu’
famiglie e sulla popolazione generale facilita l’interpretazione)
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Analisi delle mutazioni di OCA
VI
Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in
altri soggetti albini non imparentati? Se si e’ probabile
che siano patogenetiche e ritrovarne una nei fratelli
dell’affetto lo fa identificare come portatore (la mutazione
deve essere presente in eterozigosi in un genitore)
Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in
altri soggetti albini non imparentati? Se no riguarda una
regione nota per essere necessaria al funzionamento della
proteina? Se si e’ probabile che sia patogenetica(cfr. sopra)
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Analisi delle mutazioni di OCA
VII
Nel gene della tirosinasi sono riportate anche mutazioni
frameshift che possono originare una proteina tronca.
Nell’albinismo oculocutaneo sono stati trovati eterozigoti
composti: soggetti affetti in cui la mutazione patogenetica
non e’ presente in omozigosi, ma la presenza di due alleli
patologici fa manifestare la malattia. I genitori ed
eventuali fratelli in cui e’ presente anche l’allele wild-type
sono eterozigoti per una sola mutazione.
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Mappa delle mutazioni di OCA
I
II
Cu(A)
III
IV
Cu(B)
Mutazioni puntiformi: patogene
Mutazioni puntiformi:polimorfismi
Mutazioni frameshift
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V