Le metodologie di studio del
cervello: SYSTEMS BIOLOGY
Alessia Stell
13.04.10
IV secolo A.C
ARISTOTELE considera il cervello come un meccanismo di
“raffreddamento” del sangue.
IV secolo A.C
IPPOCRATE ipotizza che il cervello sia sede dell’intelligenza
MEDIOEVO
Si studiano disturbi neurologici e psichiatrici
(tra cui il mal d’amore)
1674
Anton van Leeuwenhoek costruisce il primo microscopio
La nascita delle neuroscienze
“La reazione nera”
neuroni come entità singole che sono in contatto e si succedono l'una all'altra
Studio del cervello:
UN APPROCCIO RIDUZIONISTICO
Studio del cervello:
UN APPROCCIO OLISTICO
“lo studio delle interazioni e
degli interscambi che
avvengono a diversi livelli
dell’informazione biologica”
Il confronto dei due approcci
APPROCCIO RIDUZIONISTICO
APPROCCIO SYSTEMS BIOLOGY
Focalizzato su pochi geni e sui loro prodotti
proteici
I sistemi biologici vengono affrontati non più
come insieme di entità separabili, ma come
network di molecole interagenti, che si
influenzano a vicenda
Si ottiene solo una comprensione parziale dei
complessi meccanismi eziopatologici
Permette di comprendere la complessità di un
sistema in termini di cambiamenti quantitativi
e temporali.
Da dove deriva la complessità del
nostro organismo?
25.000 geni
codificanti
Il tutto è maggiore della somma delle sue singole parti
Systems Biology cerca di studiare
le PROPRIETA’ EMERGENTI
Queste proprietà sono caratteristiche inattese dell’insieme, che non possono
essere dedotte se osserviamo solo i componenti e non l’interazione complessa
Da Systems Biology
a Systems Neuroscience
302 neuroni
5000 connessioni
C.Elegans
Possono essere usati tool computazionali per definire le connessioni
Possono essere mappate le interconnessioni nervose specifiche di determinati pathways e circuiti
comportamentali
Possono essere quindi tracciate relazioni causali dirette tra l’attività neuronale e il comportamento
Da Systems Biology
a Systems Neuroscience
100 miliardi neuroni
5 x 10^14 connessioni
Devono essere utilizzati approcci diversi che consentano di comprendere la complessità
Metodi di studio di Systems Biology
Genomica
Sequencing
Epigenomica
ChIP-chip, ChIP-seQ…
Trascrittomica
Microarray e Sequencing
Proteomica
Mass Spectrometry e
Protein Microarrays
Sequencing
Porta alla determinazione della struttura primaria di un polimero
• Metodo Sanger
• Automatizzazione del metodo di Sanger
• Next-Generation Sequencing
Sequencing – Metodo Sanger
chain-terminator method
dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs), lacking a 3'-OH
group required for the formation of a phosphodiester bond
between two nucleotides
1975
Sequencing - Automatizzazione del
metodo di Sanger
1975
2000
Sequencing – SHOTGUN Sequencing
Human Genome Project
Sequencing – Next Generation
Throughput:
Costi:
Sanger: 0.1 Mbp/day
NGS: 5 Gbp/day (5000 Mbp/day)
Sanger: 500$/Mb
NGS: 1-2$/Mb
Incremento di 50.000 volte
Riduzione 500 volte
Sequencing – Next Generation
Roche
454
Illumina
Solexa
Abi
SoLID
Sequencing – Solexa Technology
Epigenomica
Modificazioni della architettura del DNA, non dovuta a modificazioni
della struttura primaria (sequenza)
• ChIp-chip / ChIP-Seq
• DamID
Epigenomica
Modificazioni degli Istoni (N-term)
Modificazioni del DNA
Acetilazione
Metilazione
Ubiquitilazione
Fosforilazione
Sumoilazione
Metilazione
Epigenomica – ChIP-chip/ChIP-Seq
Il principio della Chromatin
immunoprecipitation è quello
di ISOLARE le porzioni di
cromatina che interagiscono
con proteine specifiche (in
questo caso ISTONI) dal
complesso miscuglio di DNA,
attraverso l’uso di ANTICORPI
specifici
Epigenomica – ChIP-chip/ChIP-Seq
ChIP-Seq
Identificando le sequenze, si può capire
DOVE si localizzano i gli istoni, quanto è
compatta la cromatina, e se queste
condizioni cambiano nel tempo o in
condizioni diverse
Epigenetica - DamID (DNA adenine
methyltransferase identification)
DNA-binding protein as a fusion protein with DNA adenine methyltransferase
localizes the methyltransferase in the region of the binding site Adenosine methylation
Trascrittomica
Modificazioni dell’espressione del DNA, quindi dei livelli di RNA
messaggero
• Real Time PCR
• Expression Microarrays
Proteomica
Modificazioni del livello delle proteine all’interno di una cellula, e
della loro funzione
• Mass Spectrometry
• Protein Microarrays
Proteomica – Mass Spectrometry
Determinazione della struttura elementare di un campione o di una molecola (peptidi).
Il principio della massa si basa sul diverso rapporto massa/carica dei componenti che
vengono ionizzati e accelerati in un campo elettrico
Ionizzazione: MALDI
(matrix-assisted laser
desorption/ionization)
Campo Elettrico
Detector
Proteomica – Protein Microarrays
Per determinare la presenza e
quantificare la proteina di interesse
in un campione
Esempi di studi Systems Biology
• Epigenetica & Trascrittomica
• Genomica & Trascrittomica
• Proteomica
Biology today relies heavily on
genomic data for hypothesis
building.
Replacement from “descriptive
science” to “discovery science”
Epigenetica & Trascrittomica
altered epigenetic profiles in
human neoplasia
Cancer Biol 2009
Uso di anticorpi specifici per
Citosine metilate
ChIP-chip
Genomica & Trascrittomica
Science 2008
Scopo: identificare alterazioni geniche in pazienti con GBM, e la loro
associazione con la patologia
Genomica: sequencing  Trascrittomica:Microarrays  Fisiologia:survival
Isocitrate Dehydrogenase 1_
- non associato precedentemente con GBM
- altamente mutato in GBM (mutazioni puntiformi G>A)
- associato a miglior survival
Proteomica
Proteomica è il metodo di elezione per lo studio delle proteine delle vescicole
post-sinaptiche, poiché i profili di espressione non sono in grado di fornire dati
accurati
Identificazione dei complessi con la proteina PSD-95(post-synaptic protein)  identificarte
118 proteine
Identificazione dei pathways in cui tali proteine sono coinvolte (schizofrenia)
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing
Network
Integrazione di dati
genotipici e fenotipici
Simulazioni e informatica
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing
Network
Integrazione di dati
genotipici e fenotipici
Simulazioni e informatica
Data sharing
“omics” reaserach richiede non solo una
strumentazione high-throughput e un team
multidisciplinare di biologi, informatici, statistici, ma
richiede anche, e in modo fondamentale, un cambio di
prospettiva.
In questa nuova prospettiva assume un
ruolo fondamentale il DATA SHARING
• Brain Atlases
• Human proteome Project
Allen Brain Atlas
http://www.brain-map.org/
•
•
•
•
Mouse Brain
Developing mouse brain
Mouse spianl cord
Human Cortex
In situ Hybridization
Per combinare GENOMICA e
NEUROANATOMIA, creando una mappa di
espressione genica nel cervello
GENSAT
GENE EXPRESSION NERVOUS SYSTEM ATLAS
Database pubblico di espressione genica ne SNC di
topo allo stato embrionale e nel topo adulto
Basato su bacterial artificial chromosome (BAC)transgenic reporter mice
Human Brain proteome project
HUPO BPP is an open international project under the patronage of the Human Proteome Organisation (HUPO) that aims:
· to analyze the brain proteome of human as well as mouse models in healthy, neurodiseased and aged status with focus on Alzheimer's
and Parkinson's Disease
· to perform quantitative proteomics as well as complemantary gene expression profiling on disease-related brain areas and bodily fluids
· to advance knowledge of neurodiseases and aging in order to push new diagnostic approaches and medications
· to exchange knowledge and data with other HUPO projects and national / international initiatives in the neuroproteomic field
· to make neuroproteomic research and its results available in the scientific community and society
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing
Network
Integrazione di dati
genotipici e fenotipici
Simulazioni e informatica
Network
SYSTEMS BIOLOGY integra dati che
derivano da analisi genetiche, gene
expression, esperimenti di proteomica e
neurobiologici
NETWORKS
sistemi di unità interconnesse in grado di
interagire e influenzarsi a vicenda
Quando i network sono studiati nel loro
insieme, emergono proprietà che non
possono essere derivate dall’analisi
individuale dei componenti
WGCNA
From LISTS of genes…
…To networks
WEIGHTED GENE CO-EXPRESSION NETWORK
ANALYSIS (WGCNA)
Il profilo di espressione può essere
organizzato in networks secondo correlazioni
di espressione
WGCNA: esempio
Nature Neuroscience 2008
Cortical Areas
Caudate Nucleus
Network: esempio di studio di geni
coinvolti in Atassia
PROTEOMICA
+
BIOINFORMATICA
Identificazione di
proteine che
interagiscono con
proteine atassiaspecifiche
Identificazione di
nuovi partner
attraverso lo studio
di database di
interazioni  altre
7000 proteine
Identificazione di
nuovi pathway
coinvolti in atassia
e altre patologie
degenerative
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing
Network
Integrazione di dati
genotipici e fenotipici
Simulazioni e informatica
Integrating genotypic and phenotypic
data
Expression Quantitative Trait Locus
(eQTL) analysis
Genotypic Data:
SNPs in un campione di pazienti
Phenotypic Data:
Espressione Genica
Determinare quali regioni del genoma sono più
INDICATIVE di uno stato fisiologico o patologico
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing
Network
Integrazione di dati
genotipici e fenotipici
Simulazioni e informatica
Simulazioni e Bioinformatica
“We’re literally drowning in data. We have lots
of scientists who spend their life working out
important details, but we have virtually no idea
how all these details connect together.
Blue Brain is about showing people the whole.”
(Henry Markram, director of BBP)
Simulazioni e Bioinformatica
BLUE BRAIN PROJECT
- Iniziato nel 2005
- Più di 2000 microchips connessi
- 22.800 miliardi di operazioni al secondo
Raggiunto primo traguardo:
Simulazione del firing in una colonna neocorticale
(10.000 neuroni/30 milioni di connessioni)
Conclusioni
• Systems Biology è “lo studio delle interazioni e
degli interscambi che avvengono a diversi
livelli dell’informazione biologica”
• E’ possibile grazie all’avvento di nuove
tecniche di throughput e informatiche
Conclusioni
Le scienze “omiche” non andranno a sostituire le
scienze riduzionistiche. Gli approcci “omici” offrono
una nuova base su cui le scienze riduzionistiche
possono essere fondate, dal momento in cui
permettono di testare molte ipotesi in parallelo e
offrono un contesto di ampio respiro per
l’interpretazione dei dati.