IL DNA CLONATO PUO’ VENIRE ESPRESSO IN CELLULE
BATTERICHE O EUCARIOTICHE
promotore
ATG
cDNA
stop
PA
trascrizione
proteina
Produzione/
Purificazione
Caratterizzazione
funzionale
cDNA
MCS
P
Promotore regolabile
(inducibile, ad es. lac)
cDNA
MCS
P
Espressione di proteine ricombinanti
BATTERI:
• Trasformazione
• Induzione della trascrizione
• Produzione proteina ricombinante
• Purificazione
CELLULE EUCARIOTICHE:
• Trasfezione stabile o transiente, oppure infezione con
vettori virali
• Induzione
• Produzione e purificazione
• Analisi funzionale
cDNA
Expression Tag,
contenente il sito di
inizio della traduzione
e una parte della
sequenza codificante
per una proteina
cosiddetta “etichetta”
(b-Gal o GFP o GST)
MCS
cDNA
MCS
Proteina di fusione
La proteina di fusione deve essere nella corretta cornice di lettura
Il dominio di legame all’ormone e’ sufficiente per
mediare la traslocazione nel nucleo in risposta ad
ormone
Organizzazione del genoma e sua evoluzione
I processi evolutivi sono caratterizzati dalla selezione di
mutazioni casuali della sequenza degli acidi nucleici che
conferiscono alle specie nuove caratteristiche favorevoli alle
condizioni ambientali.
Durante il corso dell’evoluzione uno dei fattori più
importanti è stato la possibilità di produrre nuove
proteine da quelle già esistenti. Ma come sviluppare
rapidamente nuove proteine?
Mutazioni puntiformi
Wild type
M
L
K
F
K
Y
G
V
L
N
ATG TTG AAG TTC AAG TAT GGT GTG CTG AAC
Missense
M
L
K
F
K
F
G
V
R
N
ATG TTG AAG TTC AAG TTT GGT GTG CGG AAC
Non sense
M
L
K
F
K
ATG TTG AAG TTC AAG TAG GGT GTG CTG AAC
Frame-shift
M
L
K
F
K
Y
K
V
C
ATG TTG AAG TTC AAG TAT AAG GTG TGC TGA
Grossi rimaneggiamenti del genoma
I grossi rimaneggiamenti del genoma, come le
duplicazioni, le inserzioni, le inversioni e le delezioni
possono determinare cambiamenti molto più rapidi e
radicali nella struttura dei geni. Oltre a ciò, possono
determinare profondi cambiamenti nelle modalità con
cui i geni si esprimono.
La duplicazione di tratti più o meno estesi del genoma
costituisce un meccanismo evolutivo fondamentale, in
quanto consente, nello stesso tempo, di mantenere i geni
che hanno avuto successo, e di sviluppare nuove funzioni a
partire da questi.
Duplicazione genica
Duplicazione di segmenti
cromosomici o di interi cromosomi
Il progetto genoma ha evidenziato che
questi fenomeni sono più frequenti ed
estesi di quanto si pensasse
I meccanismi di duplicazione e diversificazione consentono
di generare facilmente nuove varianti di una proteina
I meccanismi di duplicazione e diversificazione consentono
di generare facilmente nuove proteine combinando
diversi domini funzionali
Superfamiglia
delle
immunoglobuline
L’organizzazione del genoma in esoni ed introni è una
caratteristica molto antica, che rende molto più dinamica
l’evoluzione dei genomi
L’organizzazione del genoma
in esoni ed introni rende molto
più semplice l’evoluzione di
nuove proteine in seguito a
ricombinazione del DNA.
Infatti i moduli funzionali di
cui sono costituite le proteine
si trovano su singoli esoni o su
blocchi di esoni, e questo ha
consentito un notevolissimo
‘rimescolamento’ di questi
domini durante l’evoluzione
L’organizzazione del genoma in esoni ed introni rende molto
più semplice la produzione di varianti di una proteina a
partire dalla stessa unità trascrizionale
L’organizzazione del genoma in esoni ed introni rende molto
più semplice la produzione di varianti di una proteina a
partire dalla stessa unità trascrizionale
I TRASPOSONI
I trasposoni sono elementi mobili che si trovano nel genoma di tutti gli
organismi. Sono in grado, con meccanismi diversi, di saltare da un punto
all’altro del genoma. Questi salti possono determinare drastici
cambiamenti nella struttura e nelle modalità di espressione dei geni.
Appartengono a diverse classi, accomunate dalla caratteristica di avere
la sequenza trasposta fiancheggiata da corte sequenze ripetute generate
dalla duplicazione di una sequenza nel sito bersaglio
Sotto certi aspetti possono essere considerati come elementi parassitari, e
in effetti alcuni di essi sono imparentati con particolari famiglie di virus
(retrovirus). Tuttavia rappresentano un formidabile fattore positivo per
i processi evolutivi. Non a caso circa il 45% del genoma umano e’
costituito da residui di trasposoni.
Trasposoni che si muovono direttamente
Trasposasi
IR
IR
Escissione
Inserzione
Alcuni trasposoni sono portatori di mutazioni nel gene che codifica la
trasposasi, per cui non si possono muovere autonomamente.
Autonomi
IR
Trasposasi
IR
Difettivi
Trasposasi mutata
IR
IR
Esempi: Elementi Ac e Ds di mais. Trasposone batterico IS10.
Trasposoni che si muovono indirettamente
(retrovirus endogeni e retrotrasposoni o retroposoni)
IR LTR
LTR IR
Proteasi Integrasi
RT
RNAsi-H
mRNA
cDNA
Integrazione
Gli pseudogeni che si ritrovano nel genoma umano sono spesso derivati
da eventi di retrotrasposizione
Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma?
Inserzione nella sequenza codificante (o nelle sequenze di
controllo) con inattivazione totale o parziale del gene.
Trasposone
A
B
C
D
E
ATG
A
B
F
*
C
D
E
F
Per questa proprietà, i trasposoni sono molto utilizzati per mutagenizzare
e successivamante identificare i geni responsabili di particolari fenotipi.
Un organismo che si presta molto bene a questo è Drosophila
Melanogaster.
Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma?
Diversi tipi di mutazione nei punti di inserzione, sia quando si
inseriscono che quando si escindono.
Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma?
Attivazione trascrizionale del gene
Retroposone
LTR
LTR
A
B
C
D
ATG
A
B
E
F
*
C
D
E
F
Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma?
Produzione di nuove varianti alternative di una proteina
Trasposone
Promotore
A
B
C
D
E
F
A
B
C
D
E
F
Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma?
Produzione di nuove proteine
La mobilità dei trasposoni può essere molto pericolosa per le cellule
somatiche, ma la sua attività nella linea germinale aumenta le
probabilità di avere organismi con nuove caratteristiche, che possono
rivelarsi vincenti in rapporto alle condizioni ambientali
DNA ripetitivo nel genoma umano
1: DNA umano
2: DNA batterico
DNA ripetitivo nel genoma umano
DNA ripetuto in tandem
Satellite
Minisatelliti
Unità da 5 a 200 bp
Segmenti lunghi fino a
qualche centinaio
di chilobasi
(es. DNA satellite centromerico)
Unità da fino a 5 bp
Segmenti lunghi fino a 25 kb
(es. DNA telomerico - TTAGGG
DNA minis. ipervariabile ->DNA fingerprint)
Microsatelliti
Unità > 4bp
Segmenti lunghi fino150
5’-CACACACACACA-3’
Digestione
Gradiente di
densità
Genoma Umano
3000 Mb
Geni e sequenze associate
900 Mb
Non codificante
810 Mb
Introni
Codificante
90 Mb
Pseudogeni
Regioni di
controllo
DNA extragenico
2100 Mb
DNA unico e a
basso numero
di copie
1680 Mb
Ripetuto in tandem
Minisatelliti
Microsatelliti
Satellite
DNA ripetitivo
420 Mb
Disperso
SINE
LINE
Retroposoni
Il DNA spazzatura è veramente tale?