FARMACODINAMICA (PD):
descrive ciò che il farmaco fa all’organismo
(obiettivo terapeutico, rapporto rischio/
beneficio)
FARMACOCINETICA (PK):
descrive ciò che l’organismo fa al farmaco
(e in quanto tempo)
ADME
Assorbimento
Distribuzione
Metabolismo
Escrezione
ADME : definizioni
ASSORBIMENTO
Velocità: dipende da diversi fattori; per un dato farmaco è
proporzionale alla sua concentrazione a livello del sito di
assorbimento
Entità: è definita dalla competizione tra velocità di
assorbimento e velocità con cui il farmaco viene perso (p.e
per degradazione chimico-fisica, metabolizzazione o
passaggio attraverso il tratto GI)
VALUTAZIONE DELL’ ASSORBIMENTO INTESTINALE
FATTORI CHE INFLUENZANO L’ ASSORBIMENTO INTESTINALE
ESPRESSIONE DI ENZIMI FARMACO-METABOLIZZANTI NEI
DIVERSI SEGMENTI DEL TRATTO INTESTINALE
MODELLI PER LO STUDIO DELL’ASSORBIMENTO INTESTINALE
Modelli in vivo
Modelli in situ
Modelli in vitro
Modelli organotipici
Sacco intestinale rovesciato (everted drug sac)
Segmenti intestinali isolati e perfusi
Camere di Ussing
Modelli cellulari
Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA)
Test di permeabilità
MODELLI CELLULARI PER LO STUDIO DELL’ASSORBIMENTO
INTESTINALE
Sistemi non intestinali: MDCK (Madin Darby canine kidney
cells)
Linee cellulari di ratto derivate da intestino tenue fetale o
neonatale
Caco-2
amount transported
Papp (cm sec−1) =
Area * time
1
*
initial concentration
CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2
Origine
Adenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in
monostrato
Crescita
cellule epiteliali in monostrato
Differenziamento
14-21 dopo la confluenza
morfologia
Cellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola
apicale
Parametri elettrici
Resistenza elettrica elevata
Enzimi digestivi
Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell’intestino tenue
Trasporto attivo
Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni….
Trasporto ionico di
membrana
Na+,K+ ATPasi, H+,K+ ATPasi, scambiatore Na+,H+,
cotrasportatore Na+,K+, Cl-, canali apicali per Cl-
Trasportatori non ionici di
membrana
P-glicoproteina, MRPs, LRP
Recettori
Vitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio
(GLUT1,3,5 e SGLT1)
CONDIZIONI DI COLTURA PER L’USO DELLA LINEA CELLULARE Caco-2
Siero inattivato nel terreno sul
versante apicale
20%
Siero inattivato nel terreno sul
versante basolaterale
20%
rivestimento
Collagene di tipo I (non richiesto con filtri dal 0.4 μm)
Additivi
Aminoacidi non essenziali (1%)
Glucosio (25 mM)
Glutamina (2 mM)
Antibiotici (streptomicina 100 μg/l; penicillina (100mU/ml)
CO2
10 o 5%
pH
Generalmente 7.4 su entrambi i versanti, o 7.4 sul
versante basolaterale e 6.4 su quello apicale
Densità cellulare alla semina
2.5 x 103 – 4 x 103
Numero di passaggi
25 – 100
PRINCIPALI CONTROLLI DA EFFETTUARE SU CELLULE IN MONOSTRATO
Resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
260 – 420 Ω/cm2
Può indicare tossicità o perdita ddi
funzionalità delle tight junctions
Markers di differenziamento
Attività enzimatiche: saccarosio isomaltasi,
aminopeptidasi, fosfatasi alcalina
Differenziamento morfologico
Microscopia elettronica
Espressione della Pgp
Immunoistochimica, Western blot o misura
dell’attività della Pgp
Assenza di contaminazione da micoplasmi
Metodi microbiologici standard
Integrità del monostrato cellulare mediante
misura della permeabilità a composti
standard
Mannitolo, PEG
Meccanismo
Ruolo della P-gp
Ruolo delle MRP
Ruolo della LRP
Agenti
Inibitori
Verapamil
Chinidina
Ciclosporina A
 0.5 mM sul versante
apicale (A) e basolaterale (B)
0.5-1 mM in A e B
50 μM in A e B
Substrati
Rodamina 123
1 mM
Inibitori
Come i substrati
Substrati
Leucotriene C4
S2,4-dinitrofenilglutation
e
PAH
Doxorubicina
Etoposide
Vinblastina
Metotrexate
Aumento del trasposrto
dal versante A al B (se il
farmaco è posto sul
versante A)
Inibitori
Substrati
Trasporto
paracellulare
Effetti
EGTA
citocalasina
Antracicline
Aumento del trasporto,
se è paracellulare
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATOENCEFALICA
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATOENCEFALICA
BCEC (brain capillary endothelial cells) immortalizzate
condizionali ottenute da animali transgenici
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATOENCEFALICA
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATOENCEFALICA
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATOENCEFALICA
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA
SANGUE-CSF
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA
PLACENTARE
VALUTAZIONE DEL LEGAME ALLE PROTEINE
PLASMATICHE
ALBUMINA >>>
altre proteine (p.e. α-glicoproteina acida)
Spiazzamento di farmaci che legano specifici siti
Ibuprofene
Warfarin
ADME : definizioni
ELIMINAZIONE: perdita irreversibile di farmaco
dall’organismo
Velocità: proporzionale alla concentrazione del farmaco
Entità: dipende dalla competizione tra vie di eliminazione
diverse
ADME : definizioni
METABOLISMO: Perdita irreversibile di farmaco dovuta alla
formazione di nuove specie chimiche
Detossificazione/attivazione
Fase I:ossidazione (CYP-dipendente)
riduzione, idrolisi
Fase II:coniugazione
ADME : definizioni
METABOLISMO (cont.)
Principalmente a livello epatico (ma anche intestinale,
polmonare e cutaneo)
Complessità:
Induzione
Inibizione
Polimorfismi
INTERAZIONI CON ALTRI FARMACI
VARIABILITÀ
ADME : definizioni
ESCREZIONE: perdita irreversibile del composto originale
Renale: dipende dalla struttura chimica (carattere idrofilo) e
dal peso molecolare
Biliare: dipende dalla struttura chimica (è necessaria la
presenza di un gruppo non polare) e dal peso molecolare
Altre vie, generalmente meno importanti
PRIINCIPALI ENZIMI IMPLICATI NEL
METABOLISMO DEI FARMACI NELL’UOMO
Fase I: enzimi citocromo P450-dipendenti (CYP)
CYP1A2,
CYP2A6,
CYP2C9,
CYP2C19,
CYP2D6,
CYP2E1
CYP3A4
Fase II:
UDP-dependent glucuronosyl transferase (UGT),
phenol sulfotranferase (PST)
estrogen sulfotransferase (EST)
glutathione-S-transferase (GST).
STUDI METABOLICI IN VITRO
FRAZIONE EPATICA S9
MICROSOMI
in sospensione
EPATOCITI
in coltura
SUPERSOMI
% parent compound
=
disappearance
parent compound concentration (after incubation)
1−
parent compound concentration (before incubation)
. 100
X 100
Sperimentazione clinica
(Fasi I e II)
Tossicità acuta
(somministrazione singola
a dosi elevate)
Molecola
candidata
per lo
sviluppo
Tossicità per
somministrazioni ripetute
(da 1 a 6 mesi)
Mutagenesi in vitro
Tossicità dello sviluppo
(fertilità, sviluppo peri- e
post-natale, teratogenicità)
Mutagenesi in vivo
Cancerogenesi
(studio per due anni
nel topo e nel ratto)
Tossicità speciali
TEST DI TOSSICITÀ ACUTA
 valutano effetti avversi che si verificano entro un tempo
breve dalla somministrazione di una dose singola della
sostanza in esame
 devono essere effettuati almeno su due specie animali, di
cui una non roditrice;
 il farmaco deve essere somministrato secondo almeno due
vie di somministrazione
 gli animali vengono osservati per 14 gg
DL50
Dose singola, derivata statisticamente, di
una sostanza, per la quale ci si attende una
mortalità pari al 50% degli animali trattati
TEST DI TOSSICITÀ
PER SOMMINISTRAZIONI RIPETUTE
SCOPI
 ottenere informazioni sulla tossicità di un prodotto
medicinale prevedibilmente destinato ad essere somministrato
ripetutamente
 valutare i rischi connessi con l’impiego terapeutico del
prodotto stesso, tenendo anche conto dei suoi prodotti di
biotrasformazione
TEST DI TOSSICITÀ
PER SOMMINISTRAZIONI RIPETUTE
Durata proposta per il
trattamento nell’uomo
Durata suggerita per gli
studi di tossicità
Una o più dosi nell’arco di 24h
2 settimane
(studi di tossicità acuta)
Fino a 7 gg
4 settimane
(studi di tossicità subacuta)
Fino a 30 gg
3 mesi
(studi di tossicità subcronica)
Oltre 30 gg
6 mesi
(studi di tossicità cronica)
Test di tossicità dello sviluppo
i.
ii.
iii.
iv.
v.
vi.
vii.
viii.
ix.
Modifiche della fertilità o procreazione anormale
Interferenza con le fasi del pre-impianto e dell’impianto dello
sviluppo fetale
Effetti tossici sull’embrione
Effetti tossici sul feto
Modifiche della fisiologia materna con conseguenti effetti tossici
secondari sull’embrione o sul feto
Effetti sulla crescita e sullo sviluppo dell’utero o della placenta
Interferenza con il parto
Effetti sullo sviluppo post-natale, sull’allattamento e sulla
capacità di prendere il latte da parte dei nati
Effetti tardivi sulla discendenza
Test di tossicità dello sviluppo
Segmento
Segmento
Segmento
Segmento
I - Test di performance riproduttiva e fertilità generale
II – Teratogenesi
III – Tossicità peri- e post-natale
IV – Studi multigenerazionali
Test di cancerogenesi
Sono di norma indispensabili
a)
Quando appare possibile che un farmaco sia somministrato con
regolarità per un periodo di tempo abbastanza lungo
b)
Quando la struttura chimica del farmaco fa sospettare un
potenziale effetto cancerogeno
c)
Quando il farmaco può suscitare dubbi a causa di
i. Aspetti specifici della sua azione biologica
ii. Quadro di tossicità o ritenzione a lungotermine rilevati da studi
precedenti
iii. Positività in prove di mutagenesi e/o di cancerogenesi a breve
termine
Good Laboratory Practice (GLP)
Quality system concerned with the organisational
process and the conditions under which non-clinical health and
environmental safety studies are planned, performed,
monitored, recorded, archived and reported.
1.
SVILUPPO CHIMICO
 Sintesi chimica: come produrre il farmaco in modo
efficiente
 “Commercial manufacturing”: come produrre il
farmaco in modo economico
 Formulazione: come preparare il farmaco in una
forma adatta per la somministrazione