Alessia Stell Adriana Maggi Lab 2 Dicembre 2010 Ingegneria animale e animali transgenici Manipolazione genetica tradizionale Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica tradizionale a quella moderna? 1967: Scoperta della DNA ligasi 1968: Scoperta degli enzimi di restrizione 1972: Avanzamenti nelle tecniche di trasferimento del DNA e nell’uso di plasmidi Animale Transgenico: animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno Transgene: frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali Metodi di Ingegneria animale Sono 3 i metodi principali di ingegneria animale Transgenesi standard Gene Targeting Clonazione Transgenesi standard Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata • SCOPO: Guadagno di funzione • CARATTERISTICA: inserzione random, casuale Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei due pronuclei della cellula uovo fecondata La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti Cocktail ormonale per la superovulazione: • PMS (pregnant mares serum) • HCG (human chorionic gonadotropin) ♀ 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” Accoppiamento 4. Screening della progenie Raccolta degli oociti fecondati ♀ ♀ ♂ La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti Costruzione del transgene 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” Amplificazione del transgene 4. Screening della progenie Purificazione del transgene La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida ♀ 100-200X ♂ vasectomizzato ♀ pseudogravida La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Estrazione DNA dalle code della progenie Analisi tramite PCR M C 1 2 3 Analisi tramite Southern-blot 4 5 C 1 2 3 4 5 L’inserzione del transgene è casuale • RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA • Non si sa dove si è localizzato il transgene; • Non si può regolare il numero di copie introdotte nel pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l’integrazione; • Guadagno di funzione o perdita di funzione? “Incrociamo le dita!!” Gene Targeting Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells • SCOPO: Perdita o modifica di funzione • CARATTERISTICA: inserzione mirata La RICOMBINAZIONE OMOLOGA è il meccanismo che permette il gene targeting AGGTGCCTGACT X AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA Gene inattivo X TTCAGCCGATCCA La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Preparazione del transgene Gene non attivo Tk - thymidine kinase Sequenze di ricombinazione Omologa Neor – resistenza alla Neomicina Elettroporazione La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Trattamento con neomicina e ganciclovir No integrazione Gene non attivo Tk - thymidine kinase Sequenze di ricombinazione Omologa Neor – resistenza alla Neomicina X Integrazione sito-specifica (1/1000) Integrazione random X La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie ES inserite in una blastocisti di topo nero La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte 1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES Topo “chimera” 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie L’inserzione del transgene è mirata • RICOMBINAZIONE OMOLOGA • Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del transgene; • Problemi: espressione tempo e spazio specifica? “Obiettivo raggiunto!” Clonazione Trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un oocita anucleato • SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse I Cloni vengono ottenuti attraverso Somatic Cell Nuclear Transfer Il materiale genetico viene copiato in toto • Nuclear Transfer • Le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo possono essere ingegnerizzate prima del reimpianto. Altre tipologie di Ingegneria animale Altre tecniche, oltre a quelle classiche, sono state sviluppate in ingegneria animale Knockout condizionali Animali reporter Knockout condizionali Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo • SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout. Il sistema Cre-LoxP è uno dei sistemi più utilizzati La CRE è una RICOMBINASI LOXP sono le sequenze riconosciute da CRE Gene da excidere Esempio: delezione di IGF-1 fegato-specifica: topi LID (liver IGF1 specific deficient) Esone 4 Cre X Promotore dell’albumina LoxP X CRE 80% IGF-I plasmatico Animali reporter Inserimento di un gene codificante una proteina facilmente identificabile e rilevabile • SCOPO: la proteina reporter dà informazioni rapide e dinamiche sugli eventi molecolari che si vogliono studiare La luciferasi è uno dei geni reporter più utilizzati nei topi Sequenze regolatorie • Gene ESOGENO • Emivita breve • Facilmente detectabile Esempio: il topo reporter ERE-Luc MAR ERE X2 Tk Luciferasi Transgene inserito nel topo ERE-Luc MAR Applicazioni pratiche dell’ Ingegneria animale Transgenesi standard Gene targeting Studio di funzione genica (ricerca di base) Modelli di patologia umana Produzione di biofarmaci Clonaggio KO condizionale Animale reporter Screening di farmaci Produzione di organi per xenotrapianti Studio di funzione genica (ricerca di base) Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard Palmiter et al, Nature, 1982 Delezione di un gene tramite gene targeting Modelli di patologia umana Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard: Delezione di un gene tramite gene targeting: • Apolipoproteina E: aterosclerosi • Oncogeni (c-neu, c-myc, H-ras): tumori • Glucocerebrosidasi: malattia di Gaucher • Antigeni di istocompatibilità: autoimmunità • CFTR umana: fibrosi cistica • β-globina umana: talassemia • […] • Recettore LDL: aterosclerosi • APP umana: morbo di Alzheimer Esempio: modelli di overespressione di APP umana per lo studio della malattia di Alzheimer Lord A, Neurobiol Aging, 2006 + Emoglobina + tPA + GH + Insulina Produzione di biofarmaci Produzione di proteine ricombinanti biologicamente attive nella ghiandola mammaria di animali transgenici Pro/contro del “biopharming” • Abbondanza: 5–10g/L al giorno paragonato ad 1 g/L delle cellule. • Tempistiche: lunghi tempi per messa a punto e valudazione di animali transgenici • Costo • Attesa della lattazione • Adattabilità alle richieste • Funzionalità: le proteine sono folded in maniera naturale • Raccolta: facile purificazione dal latte • Inserzione casuale: può causare problemi all’animale Screening di farmaci Promotore attivato REPORTER • L’attività del promotore è osservata in tempo reale e nel contesto fisiologico dell’intero organismo Che caratteristiche deve avere un animale reporter per permettere lo screening di farmaci? • Permettere di localizzare le aree dove il composto è attivo • Permettere di valutare la risposta del farmaco dopo ripetute somministrazioni • Permettere la misurazione della minima dose efficace • Permettere di identificare siti di accumulo in caso di somministrazioni croniche Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in acuto Nelle aree del corpo dell’animale Nelle aree del cervello dell’animale Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in cronico Produzione di organi per xenotrapianti Inserimento in animali transgenici della fucosio-transferasi Rigetto dovuto alla reattività degli anticorpi umani verso le proteine endoteliali esogene (che mancano di uno zucchero, il fucosio)