AZIENDA OSPEDALIERA - COSENZA
PRESIDIO OSPEDALIERO DELL’ANNUNZIATA
Laboratorio di Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare
Direttore : Dr. Cristina Giraldi
Manuale Operativo
delle Procedure
in Microbiologia
Redatto 30.06.2007
Dott.ssa Saveria Dodaro
Validato 01.02.2008
Dott.ssa Cristina Giraldi
Dott.ssa Paolina Cavalcanti
Dott.ssa Maria Agnese Filia
Dott.ssa Daniela Perugini
Tecnico Bice Casazzone
Tecnico Nadia Elia
Tecnico Carmela Gaccione
Tecnico Paola Pingitore
Revisionato il 31.01.2010
31.01.2011
INDICE
pag. 1
1. Coltura su terreno liquido
pag. 2
2. Coltura su terreno solido
pag. 3
2.1. Coltura dei tamponi con terreno di trasporto
pag. 3
2.2. Spermiocoltura
pag. 3
2.3. Coprocoltura
pag. 4
2.4. Urinocoltura
pag. 4
2.5. Coltura del bronco aspirato da cannula di aspirazione
pag. 4
2.6. Coltura dell’escreato
pag. 5
2.7. Coltura del bronco aspirato e del broncolavaggio
pag. 5
2.8. Coltura dell’aspirato esofageo
pag. 5
2.9. Coltura di squame cutanee e raglage ungueali
pag. 5
3. Conta e coltura del liquido peritoneale
pag. 6
4. Esame chimico fisico del L.C.R.
pag. 7
5. Emocoltura
pag. 8
5.1. Inserimento dei campioni
pag. 8
5.2. Ripasso dei flaconi positivi
pag. 8
6. Coltura quantitativa e semiquantitativa dei cateteri venosi
pag. 9
7. Ricerca di Micoplasma e Ureaplasma
pag. 9
8. Immunofluorescenza diretta
pag. 9
9. E.L.I.S.A.
pag. 10
10. Immunocromatografia
pag. 10
11. Agglutinazine al lattice
pag. 10
12. Microscopia
pag. 11
12.1. Esame microscopico a fresco
pag. 11
12.2. Esame microscopico con soluzione di Lugol
pag. 11
12.3. Esame microscopico con Bleu di Lattofenolo
pag. 11
12.4. Esame microscopico previa colorazione di Gram
pag. 12
12.5. Esame microscopico previa colorazione di May Grunwald Giemsa
pag. 12
12.6. Esame microscopico previa colorazione di Ziehl-Neelsen
pag. 13
12.7. Esame microscopico previa colorazione con Auramina-Rodamina
pag. 13
13. Polymerase Chain Reaction
pag. 13
14. Immunoblot
pag. 13
15. Identificazione dei microrganismi
pag. 14
16. Prove di chemiosensibilità dei microrganismi
pag. 14
17. Ricerca micobatteri
pag. 15
18. Ricerca Chlamydia pn., Legionella pn., Micoplasma pn. su mater. respiratorio
pag. 16
Figure
pag. 17
Elenco allegati
pag. 18
-1-
1. Coltura su terreno liquido.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
liquido sinoviale;
-
liquido pleurico;
-
liquido pericardio;
-
liquido ascitico;
-
drenaggio;
-
ascesso;
-
pus;
-
protesi (eccetto i cateteri venosi, trattati nel capitolo 6).
1.1. Prelevare con una pipetta sterile circa 2 ml del campione ed inocularlo in un tubo di brodo
Thioglicollato. In caso di protesi di piccole dimensioni inserire l’intero pezzo nel brodo.
Eseguire questa operazione in prossimità della fiamma del becco Bunsen per ridurre il rischio di
contaminazione.
1.2. Avvitare strettamente il tappo a vite del brodo e miscelare delicatamente per inversione.
1.3. Allentare il tappo a vite ed incubare in termostato a 37°C in aria.
N.B. In caso di protesi di grandi dimensioni versare il contenuto di due tubi di brodo Thioglicollato nel
contenitore in cui si trova la protesi stessa.
-2-
2. Coltura su terreno solido.
La tipologia di piastre da utilizzare, insieme alle modalità di incubazione per i diversi campioni biologici
sono indicate nell’allegato 1.
2.1. Coltura dei tamponi con terreno di trasporto.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
tampone faringeo;
-
tampone auricolare;
-
tampone nasale;
-
tampone oculare;
-
aspirato gastrico;
-
tampone orale;
-
tampone cutaneo;
-
tampone anale;
-
tampone da ferita;
-
drenaggio;
-
ascesso;
-
pus;
-
secreto uretrale;
-
secreto vaginale;
-
secreto prostatico;
-
secreto balano-prepuziale.
2.1.1. Strisciare il tampone su una piccola superficie (circa 1 cm2) di ciascuna piastra (figura 1).
2.1.2. Con un’ansa sterile distribuire uniformemente il materiale depositato col tampone ricoprendo
circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle
strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3).
2.1.3. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
2.2. Spermiocoltura.
2.2.1. Con un’ansa sterile prelevare una goccia di sperma e distribuirlo uniformemente ricoprendo circa
1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce
parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3).
2.2.2. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
-3-
2.3. Coprocoltura.
2.3.1. Intingere un tampone sterile nelle feci (sia liquide che formate), quindi strisciare il tampone su
una piccola superficie (circa 1 cm2) di ciascuna piastra (figura 1).
2.3.2. Con un’ansa sterile distribuire uniformemente il materiale depositato col tampone ricoprendo
circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle
strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3).
2.3.3. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
2.4. Urinocoltura.
2.4.1. Miscelare gentilmente il campione senza farlo venire a contatto con il tappo del contenitore ed
evitando la formazione di schiuma.
2.4.2. Immergere nell’urina l’estremità di un’ansa calibrata da 10 μl (di colore bleu) appena al di sotto
della superficie e depositare la goccia al centro della piastra (figura 4).
2.4.3. Con la stessa ansa eseguire 2-3 passaggi sulla goccia lungo il diametro della piastra (figura 5) e
poi eseguire una strisciata continua lungo tutta la piastra con movimenti perpendicolari al
diametro della piastra (figura 6).
2.4.4. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
2.5. Coltura del broncoaspirato da cannula di aspirazione
2.5.1. Dopo aver sterilizzato una forbice mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen,
tagliare il tubo (compreso l’involucro di carta plastificata che l ricopre) in prossimità di una
raccolta di materiale.
2.5.2. Facendo attenzione a non toccare l’involucro esterno, inserire un tampone piccolo (usato per i
prelievi uretrali e/o nasali) nella cannula ruotandolo delicatamente così da prelevare il materiale
respiratorio.
2.5.3. Stemperare il materiale prelevato in 1 ml di soluzione fisiologica sterile.
2.5.4. Aggiungere un egual volume di fluidificante pronto uso (Sputagest) (frigo A) e vortexare.
2.5.5. Incubare 15-30 minuti in termostato quindi vortexare.
2.5.6. Prelevare 30-50 mcl di campione ed effettuare il citospot
2.5.7. Prelevare 1 ml del campione e diluirlo in 9 ml di soluzione fisiologica sterile
2.5.8. Di quest’ultimo campione diluito prelevare con un’ansa sterile da 10 mcl (ansa bleu) o con una
pipetta 10 mcl di materiale e depositarlo su tutte le piastre come in figura 1. Distribuire lo
stesso con un’ansa sterile ricoprendo circa 1/5 della superficie delle piastre (figura 2). Sempre
-4-
con la stessa ansa eseguire delle strisce in maniera tale da ridurre progressivamente la carica
microbica (figura 7).
2.5.9. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
2.6. Coltura dell’escreato.
2.6.1. Aggiungere al campione un egual volume di fluidificante pronto uso (Sputagest) (frigo A) e
vortexare.
2.6.2. Incubare 15-30 minuti in termostato quindi vortexare.
2.6.3. Prelevare 30-50 mcl di campione ed effettuare il citospot
2.6.4. Con un’ansa sterile da 10 mcl (ansa bleu) o con una pipetta prelevare 10 mcl di materiale e
depositarlo su tutte le piastre come in figura 1. Distribuire lo stesso con un’ansa sterile
ricoprendo circa 1/5 della superficie delle piastre (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire
delle strisce in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 7).
2.6.5. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
2.7. Coltura del broncoaspirato e del broncolavaggio.
2.7.1. Se necessaria la fluidificazione procedere come per l’escreato (da 2.6.1. a 2.6.5.)
2.7.2. Se il campione è già sufficientemente fluido procedere senza fluidificazione (da 2.6.3. a 2.6.5.)
2.8. Coltura dell’aspirato esofageo.
2.8.1. Centrifugare il campione a 1500 rpm per 15 minuti.
2.8.2. Eliminare il surnatante.
2.8.3. Con un’ansa sterile prelevare una goccia di materiale e distribuirlo uniformemente ricoprendo
circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle
strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3).
2.8.4. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
2.9. Coltura di squame cutanee e raglage ungueali.
2.9.1. Depositare le squame prelevate sulle piastre.
2.9.2. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso l’alto.
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3. Conta e coltura del liquido peritoneale.
3.1. Disinfettare accuratamente la sacca e con una siringa prelevare circa 20 ml di liquido.
3.2. Eseguire la conta dei globuli bianchi in camera di Burker.
3.2.1. Se la conta è ≤ 100/mm3, inoculare circa 2 ml del campione in un tubo di brodo Thioglicollato.
Eseguire questa operazione in prossimità della fiamma del becco Bunsen per ridurre il rischio di
contaminazione.
3.2.1.1. Avvitare strettamente il tappo a vite del brodo e miscelare delicatamente per inversione.
3.2.1.2. Allentare il tappo a vite ed incubare in termostato a 37°C in aria.
3.2.2. Se la conta è > 100/mm3, centrifugare 50 ml di liquido a 3000 rpm per 10 minuti.
3.2.2.1. Eliminare il surnatante ed eseguire l’esame microscopico previa colorazione di Gram.
3.2.2.2. Risospendere il sedimento in 10 ml di acqua distillata sterile e agitare vigorosamente al vortex.
3.2.2.3. Centrifugare a 3000 rpm per 10 minuti.
3.2.2.4. Eliminare il surnatante e risospendere il sedimento con circa 200 μl di acqua distillata sterile.
3.2.2.5. Con un’ansa sterile prelevare una goccia di materiale e distribuirlo uniformemente ricoprendo
circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle
strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3).
3.2.2.6. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
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4. Esame chimico-fisico del L.C.R.
4.1. Stampare il foglio di lavoro (PDL -> Stampa Microbiologia -> Liquor Ceflorachidiano -> Selezione ->
Stampa) ed annotare l’aspetto del L.C.R.
4.2. Eseguire la conta dei globuli bianchi in camera di Burker ed annotarle sul PDL.
4.3. Centrifugare a 3000 rpm per 10 minuti.
4.4. Separare il surnatante dal sedimento.
4.5. Utilizzare circa 200 μl di surnatante per il dosaggio del glucosio in Laboratorio Analisi.
4.6. Utilizzare circa 800 μl di surnatante per il dosaggio di IgG e Albumina mediante metodo
nefelometrico (per tale procedura si rimanda al manuale del settore di competenza della
nefelometria).
4.7. Se il L.C.R. è limpido e nei limiti di cellularità normale risospendere il sedimento con una piccola
quantità di surnatante ed inocularlo in un tubo di brodo .
Eseguire questa operazione in prossimità della fiamma del becco Bunsen per ridurre il rischio di
contaminazione.
4.7.1. Avvitare strettamente il tappo a vite del brodo e miscelare delicatamente per inversione.
4.7.2. Allentare il tappo a vite ed incubare in termostato a 37°C in aria.
4.7.3. Con un’ansa sterile prelevare una goccia di materiale e distribuirlo uniformemente ricoprendo
circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle
strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3).
4.7.4. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
4.8. Se il L.C.R. è torbido e con valori anormali di cellule, eseguire sul sedimento l’esame microscopico
(Gram e May Grumwald Giemsa). Tale procedura è indicata nel capitolo 12 (12.4. e 12.6.).
4.9. Se necessario eseguire la ricerca di antigeni batterici seguendo la metodica indicata sul Manuale
delle urgenze.
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5. Emocoltura.
5.1. Inserimento dei campioni.
5.1.1. Stampare il foglio di lavoro, numerare i flaconi (numero/giorno) ed applicare il bar-code di
ciascun flacone sul foglio di lavoro.
5.1.2. Aprire gli sportelli dello strumento BACTEC 9240 (prima il destro e poi il sinistro) e utilizzando il
lettore di bar-code selezionare la voce “Inserimento dei flaconi” presente all’interno dello
sportello.
5.1.3. Leggere il bar-code del flacone ed inserirlo in corrispondenza del led luminoso che si accende.
5.1.4. Ripetere la procedura per tutti i flaconi da inserire quindi riporre il lettore di bar-code e
chiudere gli sportelli.
5.2. Ripasso dei flaconi postivi.
5.2.1. Aprire gli sportelli dello strumento BACTEC 9240 (prima il destro e poi il sinistro) e utilizzando il
lettore di bar-code selezionare la voce “Rimozione dei flaconi positivi” presente all’interno dello
sportello.
5.2.2. Rimuovere i flaconi corrispondenti ai led rossi e leggere il bar-code di ciascun flacone rimosso.
5.2.3. Riporre il lettore di bar-code e chiudere gli sportelli.
5.2.4. Trascrivere sul foglio di lavoro all’interno del registro la positività e il tipo di flacone (Ped’s,
Aerobic, Anaerobic, Mycosis).
5.2.5. Prelevare mediante siringa circa 1 mL di brodocoltura.
5.2.6. Depositare una goccia su un vetrino per eseguire l’esame microscopico (a fresco e con colorazione
di Gram) ed una goccia su ciascuna piastra indicata nell’allegato 1.
5.2.7. Con un’ansa sterile distribuire la goccia uniformemente ricoprendo circa 1/5 della superficie della
piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce parallele in maniera tale da
ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3).
5.2.8. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
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6. Coltura quantitativa e semiquantitativa dei cateteri venosi.
6.1. Coltura semiquantitativa
6.1.1. Posizionare il catetere al centro della prima piastra, se troppo lungo tagliare una parte (opposta
alla punta).
6.1.2. Con un’ansa sterile far rotolare 5-6 volte il catetere sulla superficie della piastra di agar sangue.
6.2. Coltura quantitativa
6.2.1. Posizionare il catetere nella provetta contenente il brodo di coltura., con la punta rivolta verso il
basso
6.2.2. Tappare la provetta e sonicare per 1 minuto e vortexare per 30 secondi.
6.2.3. Immergere nel brodo l’estremità di un’ansa calibrata da 10 μl (di colore bleu) appena al di sotto
della superficie e depositare la goccia al centro della piastra agar sangue (figura 4).
6.2.4. Con la stessa ansa eseguire 2-3 passaggi sulla goccia lungo il diametro della piastra (figura 5) e
poi eseguire una strisciata continua lungo tutta la piastra con movimenti perpendicolari al
diametro della piastra (figura 6).
6.2.5. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso e la provetta con il brodo di coltura
dopo averla ritappata.
7. Ricerca di Micoplasma e Ureaplasma.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
urine (secondo getto);
-
sperma;
-
secreto uretrale;
-
secreto vaginale;
-
secreto prostatico.
Per tale procedura si rimanda alle istruzioni del kit diagnostico attualmente in uso (allegato 2).
8. Immunofluorescenza diretta.
Per tali procedure si rimanda alle istruzioni dei kit diagnostici attualmente in uso (allegati).
Si esegue sui seguenti campioni:
-
escreato o broncoaspirato per la ricerca di Pneumocistis carinii (allegato 3);
-
aspirato naso-faringeo per la ricerca di Virus Respiratorio Sinciziale (allegato 4);
-
aspirato naso-faringeo per la ricerca di Adenovirus (allegato 5);
-
aspirato naso-faringeo o secrezione congiuntivale per la ricerca di Chlamydia trachomatis
(allegato 6).
-9-
9. Immunoenzimatica (E.I.A.)
Per tali procedure si rimanda alle istruzioni dei kit diagnostici attualmente in uso (allegati).
Si esegue sui seguenti campioni:
-
feci per la ricerca dell’antigene di Helicobacter pylori (allegato 7);
-
urine per la ricerca dell’antigene di Legionella pneumophila (allegato 8);
-
feci per la ricerca di Astrovirus (allegato 27);
-
feci per la ricerca di Norovirus (allegato 27).
10. Immunocromatografia.
Per tali procedure si rimanda alle istruzioni dei kit diagnostici attualmente in uso (allegati).
Si esegue sui seguenti campioni:
-
feci per la ricerca di Rotavirus (allegato 9);
-
feci per la ricerca di Adenovirus (allegato 9);
-
aspirato naso-faringeo per la ricerca di Virus Respiratorio Sinciziale (RSV) (allegato 10);
-
aspirato naso-faringeo per la ricerca di Adenovirus (allegato 10);
-
feci per la ricerca della Tossina A di Clostridium difficile (allegato 11);
-
feci per la ricerca dell’Antigene di Clostridium difficile (allegato 11);
-
urine per la ricerca dell’Antigene di Streptococcus pneumoniae (allegato 25);
-
urine per la ricerca dell’Antigene di Legionella pneumophila (allegato 25);
-
sangue intero per la ricerca di Plasmodium sp. (allegato 26).
11. Agglutinazione al lattice.
Per tali procedure si rimanda alle istruzioni dei kit diagnostici attualmente in uso (allegati).
Si esegue sui seguenti campioni:
-
L.C.R. per la ricerca di antigeni batterici in caso di meningite (allegato 12)
-
siero o L.C.R. o BAL per la ricerca dell’antigene di Criptococcus neoformans (allegato 13);
-
colonie isolate su piastra per l’identificazione di gruppo degli Streptococchi β-emolitici
(allegato 14);
-
colonie isolate su piastra per l’identificazione di Staphylococcus aureus (allegato 15);
-
colonie isolate su piastra per l’identificazione di Staphylococcus aureus Meticillino Resistente
(allegato 16);
-
colonie isolate su piastra per l’identificazione di gruppo delle Salmonelle (allegato 17).
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12. Microscopia.
12.1. Esame microscopico a fresco.
Si esegue per la ricerca di lieviti e Trichomonas vaginalis sui seguenti campioni:
-
sedimenti urinari;
-
sperma;
-
secreto uretrale;
-
secreto vaginale;
-
secreto prostatico.
12.1.1. Prelevare una piccola quantità di materiale e depositarla su un vetrino portaoggetto.
12.1.2. Coprire con un vetrino coprioggetto.
12.1.3. Osservare al microscopio prima a 10X e poi a 40X.
12.2. Esame microscopico con soluzione di Lugol.
Si esegue per la ricerca di parassiti sui seguenti campioni:
-
feci stemperate in soluzione fisiologica;
-
aspirato duodenale centrifugato.
12.2.1. Prelevare una piccola quantità di materiale e depositarla su un vetrino portaoggetto.
12.2.2. Coprire con un vetrino coprioggetto.
12.2.3. Osservare al microscopio prima a 10X e poi a 40X.
12.3. Esame microscopico con Bleu di Lattofenolo.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
colonie isolate su piastra per l’identificazione dei funghi filamentosi.
12.3.1. Depositare una goccia di Beu di Lattofenolo su un vetrino portaoggetto.
12.3.2. Utilizzando un pezzetto di nastro adesivo trasparente prelevare la parte superficiale di alcune
colonie.
12.3.3. Far aderire il nastro adesivo sul vetrino portaoggetti evitando la formazione di bolle d’aria.
12.3.4. Osservare al microscopio prima a 10X e poi a 40X.
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12.4. Esame microscopico previa colorazione di Gram.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
tampone nasale per la ricerca di Bordetella pertussis;
-
biopsia gastrica per la ricerca di Helycobagter pylori;
-
tampone ferita per la ricerca di Clostridium tetani;
-
colonie isolate su piastra per l’identificazione dei microrganismi isolati;
-
L.C.R. patologici per la ricerca di microrganismi;
-
flaconi di emocolture positive.
12.4.1. Strisciare il tampone nasale direttamente su un vetrino portaoggetto.
In caso di biopsia gastrica tagliuzzare il frammento con un bisturi sterile e depositarlo su un
vetrino portaoggetti.
In caso di colonie isolate su piastra depositare una piccola goccia di acqua distillata sterile su un
vetrino portaoggetti e stemperarvi accuratamente la colonia.
In caso di L.C.R. patologici ed emocolture positive depositarne una piccola goccia su un vetrino
portaoggetti.
12.4.2. Lasciare asciugare all’aria e fissare mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen.
12.4.3. Colorare il vetrino preparato secondo il metodo di Gram (allegato 18) ed osservare al
microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione.
12.5. Microscopia dopo colorazione di May Grunwald Giemsa.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
midollo osseo o granuloma cutaneo per la ricerca di Leishmania sp.;
-
sangue per la ricerca di Plasmodium sp.;
-
L.C.R. patologici per la differenziazione dei globuli bianchi.
12.5.1. In caso di midollo osseo o sangue allestire almeno due strisci ematologici.
In caso di granuloma cutaneo allestire i vetrini direttamente con il prelievo sulla cute.
In caso di L.C.R. patologici depositarne una piccola goccia su un vetrino portaoggetti.
12.5.2. Lasciare asciugare all’aria.
12.5.3. Colorare il vetrino preparato secondo il metodo di May Grunwald Giemsa (allegato 19) ed
osservare al microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione.
- 12 -
12.6. Esame microscopico previa colorazione di Ziehl-Neelsen.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
tampone nasale per la ricerca di Bacillo di Hansen;
-
tutti i campioni biologici per la ricerca di Micobatteri;
-
colonie su terreno solido o liquido per l’identificazione di Micobatteri.
Per tale procedura si rimanda al capitolo 17.
12.7. Esame microscopico previa colorazione con Auramina-Rodamina.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
tutti i campioni biologici per la ricerca di Micobatteri.
Per tale procedura si rimanda al capitolo 17.
13. Polymerase Chain Reaction.
13.1. Si esegue con metodo semi-automatizzato sui seguenti campioni:
-
secreto uretrale, secreto vaginale, secreto prostatico per la ricerca di Chlamydia trachomatis e
Neisseria gonorrhoeae mediante sistema Probetec fornito dalla Becton-Dickinson (;
-
secreto prostatico, sperma e urine (primo getto) per la ricerca di Chlamydia trachomatis e
Neisseria gonorrhoeae mediante Real Time PCR fornito dalla Ditta Nanogen;
-
escreato, broncoaspirato, broncolavaggio, liquido pleurico, colonie su terreno solido o liquido per
la ricerca di Mycobacterium Tuberculosis Complex mediante Real Time PCR fornito dalla Ditta
Nanogen;
-
escreato, broncoaspirato, bronco lavaggio per la ricerca di Micoplasma pneumoniae, Legionella
pneumophila, Chlamydiophila pneumoniae mediante Real Time PCR fornito dalla Ditta Nanogen;
Per tali procedure si rimanda alle istruzioni del sistema diagnostico attualmente in uso (vedi manuale
tecnico reperibile nel settore di batteriologia e di biologia molecolare).
13.2. Si esegue con metodo manuale sui seguenti campioni:
-
colonie su terreno solido o liquido utilizzato per la ricerca dei Micobatteri (allegato 20).
14. Immunoblot.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
DNA amplificato da colonie su terreno solido o liquido per l’identificazione dei Micobatteri
(allegato 21).
- 13 -
15. Identificazione dei microrganismi.
Si esegue sulle colonie isolate su piastra con metodi automatizzati e semi-automatizzati.
15.1. Identificazione di germi “comuni” (batteri e lieviti) e di germi “esigenti” (Anaerobi, Emofili,
Neisserie, Corinebatteri, Campylobacter) mediante sistema automatizzato VITEK 2. Per tali
procedure si rimanda alle istruzioni del sistema diagnostico attualmente in uso (vedi manuale
tecnico reperibile nel settore di batteriologia).
16. Prove di chemiosensibilità dei microrganismi.
Si esegue sulle colonie isolate su piastra con metodi automatizzati e manuali.
15.1. Antibiogramma di germi “comuni” (batteri) mediante sistema automatizzato VITEK 2. Per tali
procedure si rimanda alle istruzioni del sistema diagnostico attualmente in uso (vedi manuale
tecnico reperibile nel settore di batteriologia).
15.2. Antibiogramma di germi “esigenti” (Anaerobi, Emofili, Neisserie, Lieviti) mediante sistema semiautomatizzato API-ATB. Per tali procedure si rimanda alle istruzioni del sistema diagnostico
attualmente in uso (vedi manuale tecnico reperibile nel settore di batteriologia).
15.3. Antibiogramma di germi “particolari” (S. pyogenes, S. pneumoniae, S. viridans, Lieviti) mediante
metodo manuale secondo Kirby-Bauer su piastra. La tipologia di piastre e di antibiotici da
utilizzare, insieme alle modalità di interpretazione degli aloni di inibizione e delle M.I.C. per i
diversi microrganismi sono indicate nell’allegato 22.
15.3.1. Preparare una provette sterile con circa 2 ml di soluzione fisiologica sterile.
15.3.2. Con un tampone sterile prelevare una o più colonie isolate su piastra e stemperarle nella
soluzione fisiologica fino a raggiungere una torbidità pari a 0,5 MacFarland.
15.3.3. Intingere un nuovo tampone sterile nella sospensione batterica, eliminare l’eccesso di liquido
sulla parete della provetta e strisciare su tutta la piastra in tre direzioni (orizzontale, verticale
e diagonale) avendo cura di ricoprire l’intera superficie del terreno così da consentire la
crescita confluente delle colonie.
15.3.4. Con una pinzetta sterile prelevare i singoli antibiotici (strisce o dischetti) e posizionarli sulle
piastre premendo delicatamente per farli aderire bene.
15.3.5. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso.
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17. Ricerca micobatteri.
Si esegue sui seguenti campioni:
-
escreato fluidificato;
-
broncolavaggio fluidificato;
-
liquido pleurico;
-
liquido ascitico;
-
drenaggio;
-
ascesso;
-
pus;
-
sperma;
-
urine (almeno 50 ml);
-
L.C.R. (semina diretta solo su terreno liquido, vedi 17.13)
17.1. Stampare il foglio di lavoro, numerare (numero/giorno e mese) un provettone da 50 ml (Falcon con
tappo a vite di colore bleu o rosso).
17.2. Versare il campione nel provettone e centrifugare a 3000 rpm per 20 minuti.
17.3. Eliminare il surnatante.
17.4. Raccogliere parte del sedimento con un’ansa calibrata da 1 μl (di colore bianco) e strisciare il
materiale su due vetrini portaoggetto.
17.4.1. Lasciare asciugare all’aria e fissare mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen.
17.4.2. Colorare il primo vetrino preparato secondo il metodo di Ziehl-Neelsen (allegato 23) ed
osservare al microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione.
17.4.3. Colorare il secondo vetrino preparato con la colorazione a fluorescenza (allegato 24) ed
osservare al microscopio prima a 10X e poi a 40X.
17.5. Risospendere il sedimento con 10 ml di tampone fosfato sterile, aggiungere 10 ml di
decontaminante e vortexare.
17.6. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
17.7. Aggiungere 30 ml di tampone fosfato sterile e miscelare per inversione.
17.8. Centrifugare a 3000 rpm per 20 minuti.
17.9. Eliminare il surnatante.
17.9.1. Utilizzando una pipetta Pasteur monouso risospendere il sedimento con circa 1,5 ml di tampone
fosfato sterile miscelando accuratamente ma evitando la formazione di aerosol.
17.9.2. Con la stessa pipetta monouso prelevare 0,5 ml di campione ed inocularlo in una provetta di
terreno liquido MGIT precedentemente addizionata con 0,8 ml di Supplement ed etichettata
con il numero identificativo del campione.
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17.9.3. Avvitare strettamente il tappo.
17.9.4. Con la stessa pipetta monouso inoculare 3 gocce di campione in un tubo di terreno solido
Lowenstein-Jensen etichettato con il numero identificativo del campione avendo cura di far
distribuire il liquido su tutta la superficie del terreno.
17.9.5. Lasciare il tappo leggermente allentato per consentire l’evaporazione del liquido.
17.10. Aprire il primo cassetto nell’incubatore-lettore BACTEC 9600.
17.10.1. Selezionare l’icona di inserimento dei campioni (freccia rivolta verso il basso).
17.10.2. Leggere il bar-code della provetta di terreno liquido ed inserirla in corrispondenza del led
luminoso che si accende.
17.10.3. Ripetere la procedura per tutte le provette da inserire quindi selezionare l’icona di uscita e
chiudere il cassetto.
17.10.4. Incubare il tubo di terreno solido in posizione orizzontale per favorire il contatto del campione
con tutta la superficie del terreno.
17.10.5. Dopo una settimana sollevare il tubo di terreno, stringere il tappo per evitare l’essiccamento
del terreno e proseguire l’incubazione in posizione verticale.
17.11. Conservare il residuo del campione rimasto nel provettone in congelatore a -20°C.
N.B.: Per la ricerca di Bacillo di Hansen strisciare il tampone nasale direttamente su un vetrino
portaoggetti. Lasciare asciugare all’aria e fissare mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del
becco Bunsen. Colorare il vetrino preparato secondo il metodo di Ziehl-Neelsen (allegato 23) ed
osservare al microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione.
In caso di sospetta positività del terreno solido depositare una piccola goccia di acqua distillata
sterile su un vetrino portaoggetti e stemperarvi accuratamente la colonia.
In caso di sospetta positività terreno liquido depositare una piccola goccia su un vetrino
portaoggetto.
Lasciare asciugare all’aria e fissare mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen.
Colorare il vetrino preparato secondo il metodo di Ziehl-Neelsen (allegato 23) ed osservare al
microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione.
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Figure
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
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Elenco allegati.
1. Terreni da utilizzare per i diversi campioni biologici
2. Ricerca Micoplasma e Ureaplasma
3. Immunofluorescenza diretta per la ricerca di Pneumocistis carinii
4. Immunofluorescenza diretta per la ricerca di Chlamydia trachomatis
5. E.I.A. per la ricerca dell’antigene di Helicobacter pilori
6. E.I.A. per la ricerca dell’antigene di Legionella pneumophila
7. Immunocromatografia per la ricerca di Rotavirus, Adenovirus nelle feci
8. Immunocromatografia per la ricerca di Adenovirus, RSV nell’aspirato naso-faringeo
9. Immunocromatografia per la ricerca dell’Antigene e della Tossina A di Clostridium difficile
10. Agglutinazione al lattice per la ricerca di antigeni batterici in caso di meningite
11. Agglutinazione al lattice per la ricerca dell’antigene di Criptococcus neoformans
12. Agglutinazione al lattice per l’identificazione di gruppo degli Streptococchi β-emolitici
13. Agglutinazione al lattice per l’identificazione di Staphylococcus aureus
14. Agglutinazione al lattice per l’identificazione di gruppo delle Salmonella
15. Colorazione di Gram
16. Colorazione di May Grunwald Giemsa
17. Immunoblot per l’identificazione dei Micobatteri
18. Antibiogramma secondo Kirby-Bauer
19. Colorazione di Ziehl-Neelsen
20. Immunocromatografia per la ricerca dell’Antigene di Pneumococco e Legionella nelle urine
21. Immunocromatografia per la ricerca di Plasmodium sp. nel sangue
22. E.I.A. per la ricerca di Astrovirus, Norovirus nelle feci
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