CRIOBIOLOGIA
STUDIO DELLA VITA A
BASSE TEMPERATURE
CRIOPRESERVAZIONE
• Le cellule umane e animali possono essere
criopreservate in azoto liquido a -196°C per più di 10
anni senza significativi cambiamenti delle loro
caratteristiche biologiche
• Le cellule vitali possono essere recuperate
qualsiasi momento
in
Metodica
•Raccogliere le cellule fresche oppure in fase logaritmica della
loro crescita nel caso di linee cellulari
•Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità
•Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il
sovranatante
•Preparare il medium di congelamento: medium di coltura al
20% FBS e 10% di DMSO
•Risospendere il pellet nel medium di congelamento
rapidamente ed in ghiaccio
•Distribuire 1ml nelle appropriate criovials opportunamente
siglate
•Dare inizio al processo di congelamento
Determinare il numero di cellule e la
percentuale di vitalità
•Risospendere la sospensione
cellulare in un eguale volume di
Trypan Blue (20ml sospensione
cellulare + 20 ml Trypan);
•Consentire alla sospensione di
scorrere per capillarità all’interno
della camera;
•Effettuare la conta delle cellule
non colorate e di quelle colorate.
Determinare il numero di cellule e la
percentuale di vitalità: NOTE
•Il Trypan Blue è un colorante che è in grado di
colorare in blu le cellule necrotiche;
•La percentuale di vitalità è calcolata mediante la
seguente formula:
N° di Cell. Vitali/N° di Cell. Blu + Cell. Vitali X 100
•La [ ] cellulare è calcolata mediante la seguente
formula:
N° Cell. Vitali (media 3 Quadranti) X 10.000 X 2
Punti Critici
“Risospendere il pellet nel medium di
congelamento rapidamente ed in ghiaccio”
•Il congelamento e lo scongelamento non migliorano
lo status quo delle cellule
•Gli
agenti
crioprotettivi
possono
essere
Dimetilsulfossido (DMSO) o Glicerolo; proteggono le
cellule dai danni indotti dalla formazione dei cristalli
di ghiaccio durante il criocongelamento
•La lunga esposizione a temperatura ambiente al
DMSO può danneggiare irreversibilmente le cellule
•Non è necessario sterilizzare il DMSO poiché in
forma pura è letale per i batteri
Punti Critici
Se la velocità di raffreddamento è troppo bassa , la cellula è
esposta a [ ] crescenti di soluti cellulari dovute alla
formazione di ghiaccio nel mezzo di soluzione
ALTA [ ] SOLUTI
DISIDRATAZIONE
VARIAZIONI DI pH
> PRESSIONE OSMOTICA
Punti Critici
Se la velocità di raffreddamento è troppo alta , si avrà la
formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione
che all’interno della cellula
DANNO MECCANICO
CRISTALLI INTERNI
CRISTALLI ESTERNI
DISTRUZIONE DELLA MEMBRANA
CELLULARE
ESISTE LA VELOCITA’ IDEALE?
•Il raffreddamento deve essere lento in modo tale da evitare
la formazione di ghiaccio!
•Il raffreddamento deve essere nello stesso tempo rapido in
modo tale da non danneggiare la cellula per disidratazione!
OTTIMIZZAZIONE DELLA
VELOCITA’ NEL VALORE DI
-1°C/MINUTO
QUALE SISTEMA UTILIZZARE PER LE
LINEE CELLULARI CONTINUE?
LA VELOCITA’ DI RAFFREDDAMENTO DI
-1°C/MINUTO
•Utilizzo di freezer meccanici programmabili, ma
sono molto costosi!!!
•Utilizzo di contenitori di polistirolo seguito da
trasferimento prima a -20°C e poi a -80°C
•Utilizzo dei contenitori CRIOSTEP
Contenitori Nalgene
Isopropanolo
Immediato trasferimento delle criovials a -80°C per
almeno 4 ore
Trasferimento in
Tanica Criogenica
Fase di Vapori di
Azoto Liquido
Trasferimento in
Tanica Criogenica
Fase Liquida di Azoto
CRIOPRESERVAZIONE
Vantaggi
• Si riduce il rischio di contaminazione microbica
• Si riduce il rischio di cross-contaminazione
• Si riduce il rischio di drift genetico e morfologico
• Si possono utilizzare linee cellulari a ben precisi
passaggi
• Notevole riduzione di costi e tempo
BANCA del CORDONE OMBELICALE
Che cosa è un Cordone Ombelicale?
Perché si costituiscono le
Banche di Cordone Ombelicale?
CORDONE OMBELICALE
•E’ una formazione anatomica che mette in comunicazione
la placenta con il feto
•E’ costituito da: due arterie ombelicali, una vena ombelicale
e dalla sostanza gelatinosa chiamata “Gelatina di Wharton”
•Dalla placenta origina il sangue arterioso ossigenato che in
senso centrifugo raggiunge il feto e da questo origina il
sangue venoso non ossigenato
•Subito dopo la nascita, il cordone viene reciso a circa 10
cm dal piano cutaneo del neonato e chiuso
•Dopo la recisione del cordone, i vasi ombelicali si
trombizzano rapidamente ed il moncone del cordone si
essicca assumendo un colorito bruno-nerastro
Come si colleziona il Sangue Cordonale?
Due Tecniche di Raccolta
1)Raccolta del sangue cordonale mentre la
placenta è ancora in utero
2)Raccolta del sangue cordonale dopo
l’allontanamento della placenta
Vantaggi della I Tecnica
•Il volume della raccolta è maggiore se il
cordone è chiuso rapidamente
•Il volume della raccolta è consistente se la
raccolta viene effettuata repentinamente
Svantaggi della I Tecnica
•Può interferire negativamente con l’importante
processo di “secondamento”
•La tecnica di raccolta descritta non è sempre
attuabile nella sala parto
Vantaggi della II Tecnica
•La raccolta può essere effettuata da personale
paramedico
Svantaggi della II Tecnica
•Basso numero di cellule raccolte
•Aumentato rischio di contaminazioni batteriche e
formazione di coaguli
Perché si utilizzano le cellule cordonali?
Il sangue cordonale contiene
Cellule Staminali
Possono essere utilizzate per trattare un ampio
numero di patologie maligne e non maligne.
Patologie Maligne
•Leucemia Acuta Linfoblastica
•Leucemia Acuta Mieloide
•Leucemia Mieloide Cronica
•Neuroblastoma
•Anemia Refrattaria con Eccesso di
Blasti
Patologie Non-Maligne
•Anemia di Fanconi
•Anemia Severa Aplastica
•Talassemia
•Immunodeficienza Combinata Severa
•Sindrome di Lesch-Nyhan
Cord Blood
Contiene cellule staminali che si
autorinnovano, mantenendo il pool delle
cellule staminali stesse, e cellule
progenitrici più mature.
Il numero totale di queste cellule è
maggiore rispetto a quello presente nel
midollo adulto.
Classificazione delle Cellule Staminali
•TOTIPOTENTI
•PLURIPOTENTI
•MULTIPOTENTI
•OLIGOPOTENTI
•UNIPOTENTI
Wagers e Weissman
Cell, Vol 116, pp 639-648, 2004
Cellule Staminali Multipotenti
Esse sono in grado di dare origine ad un
“subset of cell lineages”
A tutt’oggi le cellule staminali
ematopoietiche multipotenti sono quelle
più studiate e caratterizzate sia
biologicamente che funzionalmente.
CURT
CIVIN
Nel 1984
scopre
l’antigene
CD34
ANTIGENE CD34
Rappresenta il marcatore delle cellule
staminali che si autorinnovano nonché
dei progenitori ematopoietici “più a
valle”
C-kit
Flt3 -Flk2
CD34
CD90
CD133
HLA-DR-
•Il CD90, il CD133 ed il CD34 sono antigeni della cellula staminale;
•Il CD90 è possibilmente coinvolto nelle interazioni cellula-cellula;
•Il CD133 è una proteina Prominin-like;
•Il C-kit o CD117 è il recettore per il fattore di crescita Stem Cell Factor;
•Flt3-Flk2 o CD135 è il recettore per Flt3 ligand ad attività tirosin-chinasica.
BANCAGGIO DI SANGUE CORDONALE
Fasi
•Deteminazione del volume di sangue da
crioconservare;
•Preparazione delle provette da dedicare ai vari test:
Emocromo, Determinazione del gruppo sanguigno,
Tipizzazione HLA, Esami di biochimica clinica e
Conta assoluta di cellule CD34;
•Preparazione della soluzione crioprotettiva;
•Inizio della fase di congelamento.
Deteminazione del Volume di Sangue da
Crioconservare
•Determinare il peso in gr. della sacca di raccolta;
•Determinare il peso lordo della sacca di raccolta
contenente il sangue cordonale;
•Determinare il peso netto sottraendo la tara al peso
lordo;
•Il peso espresso in grammi=Volume espresso in ml
•Il peso netto corrisponderà pertanto al volume totale
di sangue da crioconservare.
Determinazione dell’Emocromo
Rappresenta uno dei test più importanti della fase di
pre-congelamento
Determina il numero di cellule mononucleate da
congelare che in media è rappresentato da circa
500x10E6 cellule totali
Determinazione delle Cellule CD34
Applicazione della Metodica in Citometria a Flusso
Determina il valore assoluto delle cellule CD34+ (0,10,5%) che risulta di vitale importanza ai fini
trapiantologici.
Determinazione del numero di eritroblasti.
Conta Assoluta
Esecuzione dell’Esame Emocromocitometrico
La strumentazione è inaffidabile al di sotto di un
numero di GB inferiore a 100/ml ovvero 100.000/ml
SOLUZIONE DEL PROBLEMA
E’ necessaria una metodologia in grado di effettuare
una conta di eventi rari
Citometria a Flusso
CITOMETRO A FLUSSO
PROTOCOLLO GRATAMA JW et al,
J. Immunol. Methods, 2000
Anne M. Brocklebank and Rosemary L. Sparrow
Cytometry, 2001
Esecuzione del Saggio di Conta e Diapositive
P. Mirabelli
BC05A582 11.03.05.001
BC05A582 11.03.05.001
Biglie
R3
Cellule Morte
7-AAD positive
R1
0
0
200
400 600 800 1000
SSC-Height
200 400 600 800 1000
SSC-Height
Cellule Vitali 7-AAD Negative
Analisi delle cellule vitali
BC05A582 11.03.05.001
Monociti
Linfociti
BC05A582 11.03.05.001
like
like
0
0
200
400 600 800 1000
SSC-Height
Eritroblasti
200
400 600 800 1000
SSC-Height
Granulociti-like
BC05A582 11.03.05.001
BC05A582 11.03.05.001
R5
0
200 400 600 800 1000
SSC-Height
0
200 400 600 800 1000
SSC-Height
Numero eventi biglie : 6672
Numero eventi cellule vitali: 179634
Numero eventi cellule CD34+: 229
Nuvola di cellule CD34+
Percentuale di cellule CD34+ = 229 / 179634 = 0.13%
Valore assoluto di cellule CD34 = 229 (Eventi CD34+) / 6672 (Eventi biglie) x 49208 (Numero di biglie
Troucount presente nella provetta) / 2 (Volume finale presente nella provetta da acquisire) x 20 (Fattore di diluizione
ottenuto diluendo 100ul di sangue cordonale in 2 ml di Lisante Cloruro d’ammonio) =
16889 cellule CD34/ml
SIMPLIFIED SCHEME OF STEM CELL DIFFERENTIATION
hematopoietic stem cell
CD34
CD117
CD133
CD90
VEGFR
CD105
ALDH
ABCG2
ABCB1
CDCP1
CD318
myeloid blast
erythroid
M. Goodell
2001
ABC transporters involved in drug resistance
Gene
Protein/alias
Drug effluxed
ABCA2
ABCA2
Doxo, VP16, vinblastine
ABCB1
MDR1
Colchi, doxo, VP16
ABCC1
MRP1
Doxo, dauno, vincristine
ABCC2
MRP2
Vinblastine, cisplatinum
ABCC3
MRP3
MTX, VP16
ABCC4
MRP4
6-MP, 6-TG
ABCC5
MRP5
6-MP, 6-TG
ABCC6
MRP6
VP16
ABCC11
MRP8
5-FU
ABCG2
CDw338
Mitoxantrone, imatinib, Hoechst
Dean, 2005
Preparazione della soluzione crioprotettiva
Essa è costituita da:
•80% di Destrano, una soluzione fisiologica;
•20% di Dimetilsulfossido, l’agente crioprotettivo.
Il volume della soluzione crioprotettiva è pari a quello
della sospensione di cellule cordonali da
criopreservare
Inizio della Fase di Congelamento
•Addizionare la soluzione crioprotettiva alla
sospensione cellulare cordonale avendo cura di
lavorare in ghiaccio;
•Preparazione delle aliquote di sangue cordonale già
diluito in soluzione criopreotettiva;
•Preparazione delle aliquote-pilota per potere
eseguire test di controllo;
•Avviare la vera e propria fase di congelamento.
Punti Critici
…“Dare inizio al processo di
congelamento”…
Congelatore Programmabile
1°C/min
-25°C
5-10°C/min
-100°C
Trasferimento in Tanica Criogenica in Fase di Vapori
Trasferimento in Tanica Criogenica in Fase di Vapori
FASE DI QUARANTENA
E’ necessario esplicare durante questa fase tutti i
test atti a validare l’utilizzo del sangue cordonale a
scopi trapiantologici
• Esami microbiologici;
• Studi Funzionali mediante l’applicazione di saggi a
colonie.
TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI
EMATOPOIETICHE
QUANTE CELLULE CD34+ CORDONALI E’
NECESSARIO INFONDERE IN UN
ADULTO?
Schema:
1x105/kg
sogg. 70kg
70x105
DA UN CORDONE OMBELICALE SI RICAVANO
CIRCA 10-20 x 105 cellule totali
Pertanto l’indicazione del C.O. è attualmente limitata
all’oncologia pediatrica
Prospettive Future
• Espansione Ex-Vivo;
• Migliorare l’efficienza di Homing;
• Trapiantare più unità di sangue
cordonale.
Homing delle Cellule Staminali Ematopoietiche
Con il termine Homing si definisce quel processo
biologico che conduce le cellule staminali
ematopoietiche trapiantate a raggiungere la loro
cavità, ovvero “nicchia” nel midollo osseo.
Fasi di Homing
Le varie fasi di Homing di una cellula staminale
ematopoietica prevedono:
1.Rolling sulle cellule endoteliali attraverso il legame con
E e P-Selectine;
2.Adesione attraverso VCAM-1 espresso dalle stesse
cellule endoteliali;
3.Migrazione trans-endoteliale via VLA-4/VCAM-1 come
anche via VLA-4 e VLA-5/Fibronectina.
Perché è importante aumentare l’efficienza di
Homing?
• Perché soltanto il circa 5% di progenitori umani
CD34+ raggiunge la nicchia midollare dell’ospite!
• La percentuale è leggermente variabile e correla
con lo stato del ciclo cellulare delle cellule
primitive trapiantate;
• L’attecchimento è massimo in cellule quiescienti.
LIMITA FORTEMENTE L’USO DEL CORD BLOOD
Christopherson et al, Science 2004
Modulation of Hematopoietic Stem cells Homing
and Engrafment by CD26
Uno dei protagonisti che limita fortemente
l’Homing e quindi l’attecchimento dei progenitori
primitivi ematopoietici è la molecola CD26.
CD26 è una DPPIV/Dipeptidilpeptidasi IV che ha
la funzione di rimuovere dipeptidi dalla estremità
aminoterminale delle proteine.
CXCR4
:-)
Le cellule stromali producono
SDF-1 che attrae le cellule
positive per CXCR4.
CXCR4
1
NH2
2
3
4
Struttura generale dei
recettori per
chemochine
5
Sette domini transmembrana
HOOC
6
7
CXCR4
:-(
CD26
CD26 cliva SDF-1 bloccando il
meccanismo chemiotattico
EVIDENZE SPERIMENTALI, Science 2004
• L’espressione endogena di CD26 da parte delle
cellule del donatore modulano negativamente
l’homing e quindi l’attecchimento;
• L’inibizione dell’attività o la delezione del CD26
migliora sorprendentemente l’efficienza di
attecchimento.
Ulteriori studi sono necessari allo scopo di utilizzare
nell’ambito clinico inibitori del CD26 nel momento in cui
la sorgente staminale ematopoietica è limitata.
AMD3100
:-)
CXCR4
“Mobilizzatore”
CD26
Diprotin-A
“Esaltatore di Homing”
… Il Laboratorio è solo un
altro posto per giocare …
Kary Mullis, 1998
Premio Nobel per la chimica nel
1993 per aver scoperto la PCR
La membrana Plasmatica:
Individualità e Socialità della Cellula
(T. Alescio et al.)
SIGNIFICATO BIOLOGICO DELLA MEMBRANA
1. Isolamento
2. Comunicazione
3. Compartimentazione
4. Integrazione funzionale intracellulare
1.ISOLAMENTO
E’ una condizione necessaria a garantire l’individualità del
corpo cellulare e la sua integrità chimica; tale condizione
è fondata sulla capacità della membrana di comportarsi
come una vera e propria barriera selettiva.
•Ogni cellula mantiene una composizione chimica diversa
da quella dell’ambiente
•Ogni cellula può mantenere la sua individualità genetica
e metabolica
•Ogni cellula mantiene l’autonomia eventualmente
necessaria per la competizione dalla quale scaturisce il
processo evolutivo
2. COMUNICAZIONE
Poiché ogni cellula rappresenta un sistema termodinamico
aperto, l’isolamento non può essere assoluto ed i sistemi di
comunicazione devono assolvere a 3 compiti:
•Consentire il passaggio selettivo, in direzione definita, di
sostanze nutritive e dei prodotti di rifiuto
•Capacità di ricevere dall’esterno stimoli e segnali in
maniera tale da evocare gli eventi genetici e metabolici
adeguati che configurano risposte cellulari specifiche agli
stimoli ricevuti
•Realizzare le connessioni intercellulari dirette ed
indirette necessarie ad assicurare la solidarietà funzionale
di tutte le componenti dell’organismo
3. COMPARTIMENTAZIONE
E’ una condizione tipica degli eucarioti nei quali
l’esistenza di sistemi intracellulari di membrane
suddivide il corpo cellulare in una serie di scomparti
ciascuno dei quali può acquisire una propria attività
specializzata.
LISOSOMI
NUCLEO
4. INTEGRAZIONE FUNZIONALE INTRACELLULARE
La membrana plasmatica e le membrane intracellulari
svolgono la funzione di supporti utili per ancorare ed ordinare
in sequenze spaziali ben definite molecole destinate a
svolgere funzioni collegate ed interdipendenti
Quando gli enzimi E1, E2 ecc… si trovano in soluzione
nel citoplasma, la loro probabilità di incontro con il
rispettivo substrato è proporzionale alle loro
concentrazioni. La reazione può avvenire soltanto nel
momento in cui i movimenti disordinati di diffusione
entro la cellula, conducono all’interazione di substrati
ed enzimi.
Se invece gli enzimi E1, E2 ecc… sono strettamente
associati l’uno all’altro in un grande complesso
multienzimatico, la probabilità che il primo prodotto
intermedio, liberato da E1, incontri E2, che si trova
nelle immediate vicinanze, risulta molto maggiore.
Un’intelligente strategia biologica è
quella di inserire una sequenza di
molecole funzionalmente interdipendenti
nella compagine di un tratto di membrana
plasmatica o intracellulare; questa,
quindi, può offrire, nel caso del
complesso multienzimatico, la struttura
di supporto richiesta per la sua
integrazione funzionale.
ORGANIZZAZIONE MOLECOLARE DELLA MEMBRANA
Il modello utilizzato per lo studio della membrana
plasmatica è rappresentato dal globulo rosso dei
mammiferi per i seguenti motivi:
1. Possono essere ottenuti facilmente mediante un
prelievo di sangue periferico
2. Durante il processo di differenziamento elimimano
la maggior parte degli organelli ed il nucleo
3. Ottenimento di preparazioni assai pure della
membrane plasmatiche stesse
Le Membrane Plasmatiche sono costituite da due classi
fondamentali di componenti:
PROTEINE
LIPIDI COMPLESSI
+ MOLECOLE DI ZUCCHERI
=
GLICOLIPIDI E
GLICOPROTEINE
COMPONENTE LIPIDICA
I Diversi tipi di Lipidi che si ritrovano nelle membrane
cellulari possono essere riuniti in due classi
fondamentali:
A. Fosfolipidi
B. Sfingolipidi
Sfingomieline
Gangliosidi
Cerebrosidi
C. Colesterolo
A. Fosfolipidi
I fosfolipidi risultano dalla combinazione di una molecola di
glicerolo con due molecole di acidi grassi, una di acido
fosforico ed un raggruppamento variabile da tipo a tipo di
fosfolipide.
B. Sfingolipidi
Gli sfingolipidi sono costituiti da una molecola chiamata sfingosina
combinata con una molecola di un acido grasso. A questa struttura di
base si aggiunge un gruppo laterale di diverso tipo che conferisce alla
molecola la propria individualità; sulla base della natura di questo
gruppo si possono identificare le tre diverse sottoclassi (sfingomieline,
cerebrosidi e gangliosidi).
C. Colesterolo
E’ presente esclusivamente nelle membrane delle cellule eucariotiche.