CARATTERIZZAZIONE
ELETTROFISIOLOGICA DI
CARDIOMIOCITI
DERIVATI DA CELLULE
STAMINALI
“IN GITA A FIRENZE!!!”
30 aprile 2009
EMANUELE SALIMBENI
Università degli Studi di Firenze
Dipartimento di Farmacologia
Preclinica e Clinica
"Mario Aiazzi Mancini"
FACOLTA’ DI MEDICINA
30 aprile 2009
EMANUELE SALIMBENI
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IL CUBO
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EMANUELE SALIMBENI
CENTRI OSPITATI
Centro Interdipartimentale di Servizi di
Spettrometria di Massa (C.I.S.M.)
Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e
Biofisica Applicata (C.I.M.M.B.A.)
Centro per i Servizi di Stabulazione degli Animali
di Laboratorio (Ce.S.A.L.)
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COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A?
LABORATORIO DI
ELETTROFISIOLOGIA
CARDIACA
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Rimodellamento Elettrofisiologico e
Molecolare della cellula e tessuto
cardiaco durante lo sviluppo fisiologico
e durante alcune patologie cardiache
Studio di farmaci antiaritmici e delle
sostanze che modulano la frequenza
cardiaca.
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QUALI MODELLI?

Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di
cuore (umano o animale) patologico;

Cardiomiociti in vitro:
-cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di
cellule staminali embrionali
-cardiomiociti immortalizzati;

Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e
della regolazione dei canali HCN, che mediano
la corrente If.
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PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO?
ASSISTITO AD ALCUNI ESPERIMENTI DI
PATCH-CLAMP ESEGUTI CON DIVERSI SET-UP
SU CARDIOMICITI DERIVATI DA CELLULE
STAMINALI EMBRIONALI, VOTLI A RACCOGLIERE
DATI SU:
1. CORRENTI IONICHE;
2. POTENZIALI DI MEMBRANA;
3. POTENZIALI D’AZIONE;
4. EFFETI DI FARMACI E ALTRE
SOSTANZE SU TALI GRANDEZZE.
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L’iter delle cellule:
PRODOTTE IN AUSTRALLIA
DIFFERENZIATE IN SVIZZERA (GINEVRA)
FATTE INVECCHIARE E
CARATTERIZZATE A FIRENZE
10.000 EURO
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INVECCHIAMENTO
EARLY  15-40:
LATE 50-110:
Più facile da
mantenere.
Più difficili da
conservare.
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EARLY:
1. ICal;
2. IKr;
3. If  sparisce;
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LATE:
1. Ito
2. IK1;
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PATCH -CLAMP
PRIMO PASSO: INVECCHIAMENTO
SECONDO PASSO: DIVISIONE
(ENZIMA, VINCERE ELASTICITA’)
TERZO PASSO:PIASTRINE
(SOSPESO ENZIMA, VETRO)
QUARTO PASSO: SOLUZIONI
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INTRA (ELETTRODO):
1. FISIOLOGICA;
2. IONI DI SELZIONE;
3. EGTA.
•PH=7.2;
•PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA;
•UNICA.
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EXTRA (PIASTRINA): TYRODE
1.
2.
3.
4.
5.
NaCl  140 mM;
KCl  5,4 Mm;
MgCl2 1,2 mM;
Glucosio;
HEPES (Acido);
pH=7.3
Inseguito CaCl2 2mM;
DIFFERENZIATE
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Set-up: insieme di tutti gli elementi che
permettono di fare la misura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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microscopio;
amplificatore Axon;
multi canale;
braccio e elettrodi;
provette con dentro le
soluzioni extra-cellulari;
perfusore per fare
entrare le soluzioni nei
vetrini;
Aspiratore (occhio
posizionamento);
Aspiratore per suzione
Rilevatore temperatura.
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SEAL
1.
2.
3.
4.
5.
Elettrodo lontano Seal=200 MΏ;
Elettrodo appoggiato Seal=3 MΏ;
Suzione Seal=50 MΏ;
Rottura Seal=80 MΏ;
Perfusione e ulteriore suzione=100 MΏ.
Il GΏ E’ UN SOGNO!!!!!!!
•PROBLEMI DI PERFUSIONE (TROPPO, POCO…)
•TENUTA DELL’HOLDER.
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PROTOCOLLO
I=V/Rseal  Rseal sale  I scende
PULSE 2 mV
PERFUSIONE: AIUTA LA FORMAZIONE DEL SEAL
DIFFICOLTA’: CELLULE PICCOLE E
PIATTEINCUBAZIONE;
ROTTURA OVERLOAD
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POSSO ANCHE CALCOLARE





Capacità di membrana (automatico);
Reisitenza di membrana;
Time costant
Resistenza foro (apertura protocollo)
capacità foro;
Se c’è del leakage si elimina inserendo una
resistenza in serie al seal (set-up nuovo).
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STUDIO DELLE CORRENTI E DEI
POTENZIALI
1. Perfondere con la soluzione extra adatta;
2. Applicare un protocollo;
3. Registrare;
4. Fare esperimenti con protocolli e soluzioni
extra diverse (perfusione, aspirazione);
5. Ricominciare;
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If
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ESPERIMENTO
ISOPRENALINA: ANTAGONISTA DEI RECETTORI BETAADRENERGICI (AUMENTA If) PER VEDERE COME VIENE
MODULATA If NEL CORSO DELLA MATURAZIONE DELLE
CELLULE (CAMBIAMENTO CANALE)
REVERSIBILITA’  LAVAGGIO
ACETILCOLINA/CARBACOLO (ANALOGO STABILE):
CORRENTE DI POTASSIO, POICHE’ VENGONO
ATTIVATI I RECETTORI MUSCARINICI CHE
AUMENTANO LA Gk
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INaCa
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REGISTRAZIONI
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THANKS TO
ALL THE
3
C MIGers
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