INDICE
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Bromuro di Etidio
Trizol
Cloroformio
-mercaptoetanolo
Guanidina tiocianato
Dimetilsulfossido
Diaminobenzidina (DAB)
Elettroforesi
L’elettroforesi in gel è il metodo standard utilizzato per separare, identificare e purificare
frammenti di DNA
Il gel può essere costituito da agarosio o da poliacrilamide
I gel di poliacrilamide sono usati per separare frammenti di DNA < 500 bp e hanno
un’elevata risoluzione, ma sono più difficili e pericolosi da maneggiare rispetto ai gel di
agarosio
I gel di agarosio sono semplici da preparare e sono tipicamente usati per separare frammenti
di dimensioni variabili da poche centinaia di basi a 20 kb. Vengono largamente utilizzati per
la maggior parte delle analisi routinarie su DNA/RNA
L’agarosio è un polimero di carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e gelificato, forma
una matrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dell’agarosio
Reagenti
TBE: tampone più comunemente usato per l’elettroforesi
T Tris,consente il mantenimento di un valore costante di pH della soluzione
E EDTA, chela i cationi bivalenti, come il magnesio. Questo è importante,
perché la maggior parte delle nucleasi richiede cationi bivalenti per
funzionare
B Borico che fornisce l’appropriata forza ionica al tampone
Bromuro di Etidio
Uno dei coloranti più utilizzati è il bromuro di etidio, molecola organica
aromatica planare, altamente tossica, cancerogena e mutagena, in grado di
intercalarsi tra le basi azotate e di emettere luce arancio se eccitata da
radiazione UV con  compresa tra 254 e 306 nm. Questo colorante è in grado
di evidenziare quantitativi di acidi nucleici fino a 50 ng [Old e Primrose,
1994]
Agenti cancerogeni o mutageni
In base al Dlgs 626/94 si deve intendere per “agente cancerogeno” una sostanza
o un preparato che, in base alle disposizioni CEE (direttiva 67/548/CEE, direttiva
88/379/CEE) deve riportare la codifica R45 (può provocare il cancro) o R49 (può
provocare il cancro per inalazione)
Se la sostituzione dell’agente cancerogeno non e’ possibile, dovrà essere
utilizzato in un sistema chiuso; in tutti i casi e’ necessario accertarsi che
l’esposizione all’agente nocivo sia limitata
In base all’art. 64, qualora si usino agenti cancerogeni si devono applicare le
seguenti misure:
•Limitazione delle quantità nell’ambiente di lavoro
•Attuazione delle norme igieniche
•Massima riduzione possibile del numero di soggetti esposti
•Raccolta e smaltimento dei residui in condizioni di sicurezza
Dispositivi di protezione individuali
•Occhiali
•Indumenti di protezione (camice)
•Guanti protettivi
•Maschere di protezione
L’operatore può proteggersi con mezzi di prevenzione individuale,
ma l’uso di questi non può sostituire l’uso di una cappa efficiente,
ma solo integrarlo, per diminuire ulteriormente il rischio di danni
Bromuro di Etidio
T+ Molto tossico
Proprietà fisiche e chimiche
Stato: Solido
Colore: Rosso scuro
Odore: Quasi inodore
Frasi-R: 22-26-36/37/38-68 Nocivo per ingestione. Molto tossico per inalazione.
Irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle.
Possibilità di effetti irreversibili
Frasi-S: 26-28-36/37-45
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e
consultare un medico. In caso di contatto con la pelle
lavarsi immediatamente ed abbondantemente con
acqua e sapone. Usare indumenti protettivi e guanti
adatti.
Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
Frasi-R Frasi-S
• Sono chiamate frasi R alcune frasi convenzionali che descrivono i rischi
per la salute umana, animale ed ambientale connessi alla manipolazione di
sostanze chimiche
• Sono chiamate frasi S alcune frasi convenzionali che descrivono i consigli
di prudenza cui attenersi in caso di manipolazione di sostanze chimiche
• Sono frasi codificate dall'Unione Europea nella direttiva 88/379/CEE.
• Ad ogni frase è associato un codice univoco composto dalla lettera R
seguita da un numero. Ad ogni codice corrispondono le diverse traduzioni
della frase in ogni lingua ufficiale dell'Unione Europea.
• È previsto dalle attuali normative che ogni confezione di prodotto chimico
rechi sulla propria etichetta le frasi R e le frasi S corrispondenti al prodotto
chimico ivi contenuto.
Bromuro di Etidio
Evitare la contaminazione personale anche con l’uso di dispositivi di protezione
personale (camice, guanti)
I residui non devono essere dispersi nell’ambiente, ma sottoposti ad
ossidazione, o assorbimento su resine o carbone attivo. Il responsabile del
laboratorio deve scegliere una zona in cui potrà essere maneggiata tale
sostanza
La zona scelta dovrà essere segnalata in modo visibile. Tutte le operazioni che
richiedono l’impiego del bromuro di etidio dovranno essere effettuate entro l’area
evitando così contaminazioni di altre porzioni dell’ambiente lavorativo.
Accorgimenti
Per la preparazione del gel di agarosio, qualora sia possibile, bisogna utilizzare
materiale monouso:
•Sciogliere l’agarosio in una beuta di vetro
•Versare il contenuto in un contenitore di plastica monouso
Sotto cappa chimica:
•Aggiungere il Bromuro di Etidio utilizzando puntale con filtro, che, dopo
l’utilizzo deve essere gettato in contenitori appositi non perforabili presenti
sotto cappa
•Fare attenzione a non sporcare la pipetta con il colorante durante questa
operazione
•Richiudere il contenitore di plastica
•Gettarlo nell’apposito contenitore per lo smaltimento dei rifiuti fornito
dall’Azienda
Durante tutta la preparazione del gel controllare che i guanti siano puliti per
evitare qualsiasi tipo di contaminazione
Alternativa al BrEt (1)
Ove sia tecnicamente possibile e’ obbligatorio sostituire eventuali
agenti cancerogeni in uso, con altre sostanze o prodotti non nocivi o
meno nocivi
Il blu di metilene rappresenta una alternativa al bromuro di etidio
quando la concentrazione di acidi nucleici non è un fattore critico.
L'unico vantaggio è rappresentato dalla scarsa tossicità della
molecola utilizzata [Old e Primrose, 1994]
R 22: Nocivo in caso di ingestione
A temperatura ambiente si presenta come un solido blu scuro quasi inodore
Alternativa al BrEt (2)
• SYBR Green II RNA Gel Stain:è un colorante intercalante che si lega al
prodotto di PCR producendo un segnale molto intenso
• Il prodotto non è codificato conformemente alle direttive CEE/norme sulle
sostanze pericolose perché non contiene componenti pericolosi
– Sulla pelle: non ha effetti irritanti
– Sugli occhi: non irritante
– Sensibilizzazione: non si conoscono effetti sensibilizzanti
• Nella manipolazione osservare le misure di sicurezza usuali impiegate
nell’utilizzo di sostanze chimiche
Trizol
• Reagente utilizzato per le estrazioni di RNA da sangue in toto, da cellule e
da tessuto
• Permette l’estrazione contemporanea di DNA e di proteine dalla fase
organica
• Soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato
Il prodotto è classificato ed etichettato secondo Direttiva 1999/45/CE
Classificazione
Indicazione di pericolo
T Tossico
Frasi “R”
R34-Provoca ustioni
R26/27/28-Molto tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione
Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
Cloroformio
Stato fisico; Aspetto:
Liquido incolore, con odore caratteristico
R22:
Nocivo per ingestione
R38:
Irritante per la pelle
R40:
Possibilità di effetti cancerogeni- prove insufficienti
(Direttiva2001/59/CE della commissione
R48/20/22: Nocivo: pericolo di gravi danni alla salute in caso di esposizione
prolungata per inalazione ed ingestione
S(02):
(conservare fuori della portata dei bambini)
S36/37:
Usare indumenti protettivi e guanti adatti
Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
ß-mercaptoetanolo
Utilizzo: Estrazione di RNA totale da cellule eucariotiche
T+ Molto Tossico
N Pericoloso per l’ambiente
R22: Nocivo per ingestione
R24: Tossico a contatto con la pelle
R34: Provoca ustioni
Forma: Liquido
Colore: Incolore
Odore: Forte
Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
ß-mercaptoetanolo
ACCORGIMENTI
Essendo molto pericoloso, in caso di contatto cutaneo (corrosivo, assorbito
attraverso la pelle), utilizzarlo sempre indossando camice, guanti protettivi e
verificare che durante i singoli passaggi non si verifichi contaminazione degli stessi.
Utilizzare sempre puntali con filtro
Al termine dell’utilizzo, prima di chiudere la cappa chimica, verificare che il
contenitore utilizzato per lo smaltimento dei rifiuti sia chiuso per evitare dispersione
degli odori perché
Il ß-mercaptoetanolo è molto pericoloso in caso di inalazione (corrosivo per i
polmoni)
Guanidina tiocianato
Nocivo
Frasi-R
R20/21/22: nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione
R32: a contatto con acidi libera gas altamente tossici
R36/38: irritante per gli occhi e la pelle
Frasi-S
S14: conservare lontano da acidi (forti)
S23: non respirare i vapori
S36/37: usare indumenti protettivi e guanti adatti
Dimetilsulfossido
Impieghi
Preparazione della soluzione di congelamento per criopreservazione:
–
–
–
–
Linee cellulari
Sospensioni linfocitarie
CSEP
BM
Dimetilsulfossido
Xi Irritante
Frasi di Rischio
R36: Irritante per gli occhi
R37: Irritante per le vie respiratorie
R38: Irritante per la pelle
Frasi di Sicurezza
S23:
non respirare i fumi
S26:
in caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed
abbondantemente con acqua e consultare un medico
S36/37: Indossare indumenti protettivi e guanti adatti
Dimetilsulfossido
Limite di esposizione personale
Non è stato definito alcun limite di esposizione
Dispositivi di protezione individuale
Protezione respiratoria: nessuna raccomandazione specifica
Protezione degli occhi: utilizzare gli occhiali di sicurezza
Protezione delle mani: utilizzare guanti adatti
Protezione della pelle: indossare indumenti protettivi adatti
Misure da adottare in caso di versamento accidentale
Precauzioni individuali: evitare il contatto con la pelle, gli occhi e gli indumenti
Metodi di pulizia: raccogliere quanto possibile in un recipiente pulito per lo
smaltimento. Sciacquare i residui con molta acqua
Diaminobenzidina (DAB)
La morfologia è il principale criterio per la diagnosi di LAL e per la
differenziazione dalle LAM
Non sempre l’osservazione della morfologia delle cellule è sufficiente
per inquadrare con esattezza l’origine linfoide o mieloide della
leucemia perciò su di uno striscio di sangue midollare viene testata la
reazione della PEROSSIDASI
La PEROSSIDASI è un enzima che appartiene alla classe delle
ossidoriduzioni, cioè catalizza l’ossidazione di un substrato
rimuovendo due atomi di idrogeno che vengono a combinarsi con una
molecola di acqua ossigenata. Nel nostro caso il substrato è la
DIAMINOBENZIDINA
Reazione di ossidoriduzione
Per azione della perossidasi contenuta nei lisosomi cellulari, la DAB si riduce
formando un precipitato di colore giallo-bruno:
Perossidasi
+ H2O2
DAB (ossidato)
+ 2 H2O
DAB (ridotto)
Risultano positive a questa reazione le cellule che, sul vetrino, assumono una
pigmentazione granulare giallo-bruna e ciò accade per le cellule della linea
promielocitaria e monocitaria. Quando queste cellule sono presenti con una
percentuale < 3% si valuta la leucemia di origine linfocitaria
DAB
Xn Nocivo
Frasi-R
R40: possibilità di effetti irreversibili
Detergente consigliato:
acqua eventualmente con l’aggiunta di detersivi
Frasi-S
S36/37: usare indumenti protettivi e
guanti adatti
Manipolazione
Indicazioni per una manipolazione sicura:
Non sono richiesti provvedimenti particolari
Proprietà fisiche e chimiche
Forma: Liquido
Colore: Chiaro
Odore: Inodore
Stoccaggio
4°C
Non conservare a contatto con ossidanti
DAB
ACCORGIMENTI
• Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
• Utilizzare pasteur monouso e puntali con filtro
• Versare lo scarto in contenitori appositi per lo smaltimento dei rifiuti tossici
facendo attenzione a non inalare eventuali aerosol
• Lavare la vetreria con abbondante acqua e detersivi