Applicabile a:
 amminoacidi
 proteine
 acidi nucleici
 idrocarburi
 carboidrati
 prodotti farmaceutici
 pesticidi
 antibiotici
 steroidi
HPLC
Lab. Chimica Analitica II _
Effetto della dimensione delle particelle e del
flusso sull’altezza H del piatto teorico
Dimensioni colonna: 30 x 2.4 mm
Soluto: N,N-dietil-n-aminoazobenzene
Fase mobile: esano, CH2Cl2, isopropanolo
Effetto della dimensione del campione
sull’altezza H del piatto teorico
HPLC
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HPLC
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Requisiti:
 Pressioni fino a 430 atm
 Uscita priva di pulsazioni
 vflusso da 0.1 a 10 ml/min
 componenti resistenti alla corrosione
 controllo di flusso ad alta riproducibilità
Tipi di pompe utilizzati:
 alternative a pistone o diaframma
 a siringa o a spostamento
 pneumatiche o a pressione costante
HPLC
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Problematiche::
• Accuratezza e precisione
dipendenti dalla siringa
• Difficilmente applicabili ad
automazione
HPLC
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Caratteristiche del rivelatore ideale:
 Sensibilità adeguata
 Buona stabilità e riproducibilità
 Risposta lineare in un ampio intervallo
 Tempo di risposta breve
 Elevata affidabilità e facilità d’uso
 Fattore di risposta uniforme o sensibilità specifica
 Metodo di rivelazione non distruttivo
 Volume interno minimo per ridurre l’allargamento di banda
Tipi di rivelatori:
 proprietà di massa: indice di rifrazione, costante dielettrica, densità
 proprietà del soluto: assorbanza UV-Vis, fluorescenza, corrente di diffusione
HPLC
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Cella di flusso a Z:
• V = 1 – 10 l
• l = 2 – 10 mm
• pmax = 40 atm
• noti anche come rivelatori a lunghezza d’onda fissa
• utilizzano una lampada Hg a bassa pressione
• basso livello di rumore (2 x 10-5 AU)
• non sensibile a variazioni di temperatura, flusso,
composizione della fase mobile
• Lungo tempo di vita della lampada (> 1 anno)
•  fissa: 254, 250, 313, 334, 365 nm
HPLC
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• spettrofotometro a scansione con reticoli a diffrazione
• possibilità di registrare un cromatogramma a  fissa o a  diverse per ogni picco
• possibilità di utilizzo di rivelatori diode array
possibilità di ottenere diagrammi 3D
Spettri di assorbimento dell’eluito di
una miscela di tre steroidi, acquisiti ad
intervalli di 5 secondi
HPLC
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• rivelatori a tre filtri a cuneo semicircolari  4000 – 690 cm-1
• rivelatori FT-IR
• l = 0.2 – 1 mm, V = 1.5 – 10 l
• utilizzano rivelatori fotoelettrici a 90° rispetto al raggio d’eccitazione
• Sorgente a Hg o Xe, filtri o monocromatori a reticolo per isolare la radiazione
• elevata sensibilità
• possibilità di incrementare la fluorescenza mediante trattamento preliminare dei
campioni (es. 5-dimetilaminonaftalen-1-solfonil cloruro = cloruro di dansile)
• Possono avere limiti di linearità inferiori ai rivelatori di assorbanza (0.1 AU)
HPLC
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• Possono rivelare la maggior parte dei soluti, purché RI del soluto sia diverso da quello
della fase mobile
• Sensibili alla temperatura, non al flusso
• Sensibilità inferiore agli altri rivelatori
• Non applicabili all’eluizione in gradiente
• Utili su scala preparativa
HPLC
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• Basati su: amperometria,
coulombometria, voltammetria,
conduttimetria
• Elettrodo in Pt, Au, grafite vetrosa o
pasta di grafite
• V = 1 – 5 l
• Applicabile alla determinazione di
disolfuri e tioli
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HPLC
•
Rivelatori a spettrometria di massa
•
Rivelatori NMR
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Cromatogramma di
eluizione LSC
HPLC
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Possibili gruppi funzionali
sulla superficie della silice
Reazioni di silanizzazione
per la produzione di fasi
legate
HPLC
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Effetto della lunghezza di catena
sulle prestazioni di una colonna di
silossano in fase inversa riempita
con particelle di 5 m.
MeOH: H2O = 50%, 1ml/min
HPLC
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