Determinazione della fase
Cristallografia delle piccole molecole
Molecole Grandi (Proteine)
Metodi diretti
Metodo della Sostituzione Isomorfa
(Sostituzione Isomorfa Multipla – MIR,
multiple isomorphous replacement).
MIR – Introduzione di nuovi centri di scattering nella cella elementare:
 costituiti da atomi pesanti (in modo che essi contribuiscano significativamente alla
diffrazione)
 in numero limitato (per localizzarne la posizione)
 non dovrebbero cambiare le caratteristiche strutturali della molecola e della cella
(cristalli isomorfi).
In pratica la MIR si ottiene facendo diffondere diversi complessi di metalli
pesanti nei canali dei cristalli preformati. Se le catene espongono gruppi –SH,
essi legheranno i metalli. Nelle metallo-proteine i metalli leggeri possono essere
sostituiti con metalli più pesanti (es. Zn-Hg, Ca-Sm).
Determinazione della fase
I metalli pesanti contengono molti più elettroni degli atomi leggeri (H,N,O,C,S)
della proteina, diffondono i RX più intensamente. Dopo una MIR se tutte le
interferenze fossero positive tutti i raggi diffratti aumenterebbero di intensità.
Ma alcune interferenze sono negative, per cui dopo la MIR, alcuni spot
aumentano di intensità, altri diminuiscono ed altri non variano. Dalle differenze
di intensità prima e dopo la MIR, si possono dedurre le posizioni degli atomi
pesanti nel cristallo. Le trasformate di Fourier di queste diff. di intensità
forniscono le mappe dei vettori tra gli atomi pesanti (mappe di Patterson). Dalle
mappe di Patterson si possono dedurre le posizioni degli atomi pesanti nella
cella elementare, per cui da queste le ampiezze e le fasi e dal loro contributo ai
raggi diffratti dal cristallo.
Determinazione della fase
Conoscendo:



Ampiezza e fase atomi pesanti
Ampiezza proteina
Ampiezza proteina-metalli pesanti
si può calcolare se l’interferenza dei RX diffusi dai metalli pesanti e dalla
proteina è costruttiva o distruttiva. Una stima della fase della proteina si può
ottenere dall’entità dell’interferenza con le informazioni sulla fase del metallo.
Sono però possibili due differenti angoli di fase, per distinguere tra le soluzioni
possibili è necessario avere un complesso con un secondo atomo pesante che
darà altri due angoli di fase possibili per la proteina. Quello che avrà lo stesso
valore di uno degli angoli di fase determinati nel caso precedente sarà l’angolo
di fase corretto.
In pratica si devono preparare più di due complessi proteina-metallo pesante
per ottenere una fase buona per tutte le riflessioni.
Le ampiezze e le fasi dei dati ottenuti vengono impiegati per calcolare le mappe
di densità elettronica dell’unità ripetitiva del cristallo.
Costruzione del modello
La mappa di densità elettronica va interpretata in termini di catena peptidica
(sequenza aa). Vi sono però limiti dei dati:
– imprecisioni da errori negli angoli di fase
– risoluzione dei dati che dipende dall’ordine nei cristalli (misurata in A, minore è il suo
valore più elevata è la risoluzione e quindi la quantità di dettagli che si possono
osservare).
 Bassa risoluzione (>5)
forma della molecola, regioni a
elica come cilindri
 Media risoluzione (ca.3)
percorso della catena e fitting
sequenza aa
 Alta risoluzione
ca.2 – si discrimina tra catene laterali molto simili
ca.1 – atomi come sfere di densità elettronica
La costruzione del modello iniziale è un processo di prova/errore. Occorre:
 decidere in che modo la catena polipetidica traccia il suo percorso nella densità
elettronica
 si tenta di adattare in base all’ipotesi la densità delle catene laterali della sequenza
nota del polipetide
Utilizzo computer grafica
Costruzione del modello
La
mappa
di
densità
elettronica viene rappresentata
sullo schermo del computer
(computer
grafica)
in
combinazione con una parte
della catena polipeptidica.
La
mappa
di
densità
elettronica
ottenuta
viene
interpretata adattandovi parti
della catena polipeptidica con
stechiometria nota (backbone
e catene laterali).
Le
unità
della
catena
polipeptidica vengono ruotate
e traslate rispetto alla densità
elettronica fino a che si ottiene
una buona corrispondenza tra
le due.
Utilizzo mappa Fourier differenza
(sia per ‘aggiustare’ modello che
per risolvere nuove strutture).
Costruzione del modello – R-factor
Il modello viene via via corretto mediante affinamento, per cui esso viene modificato
minimizzando la differenza tra ampiezze osservate sperimentalmente e quelle calcolate
per un ipotetico cristallo contenente il modello invece della molecola reale (minimi
quadrati).
Questa differenza viene espressa come R-factor che rappresenta la discordanza residua
(R=0 per un accordo esatto, 0.59 per disaccordo totale).
Per una struttura proteica ben determinata R è compreso tra 0.15 e 0.20.
La diff. residua (ad alta risoluzione) non è dovuta a grossi errori nel modello, ma a errori
e inesattezze nei dati che derivano principalmente da:
Piccole variazioni nelle conformazione delle molecole proteiche
Correzioni inadeguate presenza solvente
Differenze orientamento microcristalli che formano il cristallo.
Il modello finale è media delle molecole (leggermente diverse in conformazione e
orientamento) presenti nel cristallo, per cui il modello non corrisponde mai in modo
esatto al cristallo reale.
La conoscenza della sequenza aa (da sequenza nucleotica nelle tecniche DNA
ricmbinante per la produzione della proteina stessa) è indispensabile per la
determinazione della struttura a RX. Le strutture determinate possono identificare errori
nella determinazione della sequenza.
Cristallo
Data Collection
|F|, (hkl)
Fasi a(hkl)
Determinazione struttura proteine
Densità elettronica
r (x,y,z)
Struttura
GMER
Actina